Bacillus Subtilis.

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- Electroforesis de ADN

La electroforesis del ADN se utiliza para la separación de macromoléculas. Esta técnica es la más utilizada en los laboratorios debido a su efectividad. Se utiliza teniendo en cuenta la carga eléctrica, el tamaño de la molécula y su propiedad física. La técnica se pudo lograr utilizando una cámara de electroforesis con el gel de agarosa, lo que tiene el propósito de separar las macromoléculas. Se comenzó añadiendo 12-20 de ADN purificado y “loading dye”, el cual contiene bromofenol azul, que hace visible la corrida del ADN y glicerol, lo que le da peso a la muestra evitando así la expulsión de los pocillos del gel. Luego, con el gel solidificado, se colocó la bandeja en la cámara de electroforesis de manera que los pocillos quedaron en el lado negativo para asegurar que las muestras migraran al lado positivo. Posteriormente, se le añadió TBE 0.5X hasta cubrir el gel por completo. Se esperó a que el “buffer” entrara a los pocillos y luego se removió cautelosamente la peinilla del gel. Después, utilizando una micro pipeta, se colocaron las muestras de ADN en dos pocillos diferentes. Se conectó la cámara a una fuente de luz o energía y se encendió para que corriera a una aproximación de 80 voltios. Se dejó migrar hasta que se encontraran a un centímetro y medio del extremo positivo. Al final se apagó el equipo y se colocó el gel bajo una lámpara de luz ultravioleta (UV) para poder observar los rastros de degradación y el tamaño del ADN purificado. Al final se descartó el gel en el recipiente de residuos sólidos. [pic 2]

- Cuantificación del ADN

Para lograr la cuantificación del ADN se utilizó un espectrofotómetro con un rango de luz ultravioleta a un largo de onda de 260nm y de 280nm. La absorbancia máxima de las soluciones de ADN es a 260nm. Sin embargo, la abundancia de las proteínas se determina midiendo a un largo de onda de 280nm. Primero, se utilizó TE para lograr una dilución de ADN en una razón de 1/20, se utilizó un TE (10mM Tris o 1mM EDTA con pH 8) o agua des ionizada estéril como blanco y se determinó la absorbancia de cada uno a 260nm y 280nm, respectivamente. Para lograr una dilución de ADN a razón de 1/20, se transfirieron 25 del ADN puro a un tubo y se le añadieron 475ul de TE y se mezcló sutilmente. Se midió la absorbancia a 260nm utilizando unas cubetas de 1mL que pudieran ser utilizadas a luz ultravioleta. Finalmente, se hicieron cálculos matemáticos para medir la concentración de ADN. La concentración de ADN a = 1.0 en una cubeta de 1 cm, equivale a 50 de ADN por cada mL de agua. Por tanto, para realizar estos cálculos:[pic 3][pic 4][pic 5]

[ADN]= (50/mL) ( (Factor de dilución)[pic 6][pic 7]

Para obtener la dilución de ADN con un factor de dilución 1/50 se llevó a cabo el mismo proceso, excepto que se diluyeron 10 de muestra de ADN en 490 de agua des ionizada y estéril. [pic 8][pic 9]

- Resultados:

- Electroforesis del ADN de Bacillus subtilis

[pic 10]

Figura 1: Migración del ADN genómico de Bacillus subtilis (carriles 6 y 7), teñido con bromuro de etidio vista bajo una lámpara de luz ultravioleta (UV). En el primer carril se observa el marcador de ADN.

Tubos

ADN

Proteína

[pic 11]

[pic 12]

A₁

0.20

0.097

B₁

0.263

0.15

A₂

0.093

0.051

B₂

0.14

0.070

- Cuantificación de ADN:

Tabla 1: Tabla de absorbancia a 260nm el largo de onda para el ADN y a 280nm el largo de onda para proteínas.

La concentración de DNA a A260 = 1.0 en una cubeta de 1 cm equivale a 50 μg de DNA por ml de agua.

A₁

- Factor de dilución:

475 agua destilada + 25 ADN= = 20 [pic 13][pic 14][pic 15][pic 16]

- Concentración de ADN:

(50 ) (20 f.d) (0.20 A₂₆₀)= 200 [pic 17][pic 18][pic 19]

- Pureza: = 2 [pic 20]

B₁

- Factor de dilución:

475 agua destilada + 25 ADN= = 20 [pic 21][pic 22][pic 23][pic 24]

- Concentración de ADN:

(50 ) (20 f.d) (0.263 A₂₆₀)= 263 [pic 25][pic 26][pic 27]

- Pureza: = 1.8 [pic 28]

A₂

- Factor de dilución:

490 agua destilada + 10 ADN= = 50 [pic 29][pic 30][pic 31][pic 32]

- Concentración de ADN:

(50 ) (50 f.d) (0.093 A₂₆₀)= 232.5 [pic 33][pic 34][pic 35]

- Pureza: = 1.8[pic 36]

B₂

- Factor de dilución:

490 agua destilada + 10 ADN= = 50 [pic 37][pic 38][pic 39][pic 40]

- Concentración de ADN:

(50 ) (50 f.d) (0.14 A₂₆₀)= 350 [pic 41][pic 42][pic 43]

- Pureza: =2[pic 44]

- Discusión:

El ADN de la bacteria Bacillus subtilis se pudo extraer primeramente rompiendo la membrana celular, lo que se logró con la aplicación de un detergente de amortiguador lisis (SDS). Luego se utilizó una mezcla de fenol-cloroformo y alcohol