Demonia de Tasmanoia.

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Para los exámenes citológicos de neoplasias cutáneas primarias, se llevaron a cabo 13 casos de cáncer facial del demonio con el microscopio óptico en frotis. Los portaobjetos se secaron al aire, se fijaron con alcohol metílico, y se tiñeron con la técnica Diff Quick. Todas las muestras de tejidos se recogieron con extracción quirúrgica o biopsias y se fijaron en formalina tamponada neutral al 10% para un máximo de 7 días y luego se procesaron de forma rutinaria en bloques de parafina, de la cual fueron cortadas y teñidas con hematoxilina y eosina, y se examinaron utilizando microscopía de luz.

Las neoplasias del cáncer facial del demonio para microscopía electrónica de transmisión (TEM) examinadas, se obtuvieron mediante la fijación de glutaraldehído directo, fijación postformalina, o de tejidos fijados en formalina incluidos en parafina (FFPE). Las muestras frescas se recogieron directamente en fijador de Karnovsky. Los tejidos FFPE fueron deparaffinados y rehidratados. Todas las muestras fijadas se lavaron a continuación en tampón cacodilato antes de ser fijadas en tetróxido de osmio durante 1h. Las muestras se lavaron en agua destilada antes de ser manchada en bloques con acetato de uranilo por 30 minutos y después se deshidrataron a través de alcohol graduado, aclaradas en óxido de propileno, infiltrado y embebido en resina EPON, y se polimerizaron en 60° C.

Secciones estudiadas se redujeron en un LKB 2088 Ultratome V y se tiñeron con azul de toluidina, y el área de interés identificado para el corte ultrafino se cortó con un cuchillo de diamante Diatome. Las secciones se colocaron en microscopía electrónica de cobre en 200 rejillas de malla hexagonal y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo antes de examen con un microscopio electrónico de transmisión Philips CM100. Se midieron tamaños nucleares y citoplasmáticos a partir de 100 células al azar, y la media y desviación estándar se determinaron utilizando una hoja de cálculo.

En el A Murine Xenograft Model for a Transmissible Cancer in Tasmanian Devil se estudió el DFTD injertado en un ratón. Un tumor DFTD primario fue retirado de un demonio de Tasmania afectado. Se enjuagó varias veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) suplementado con penicilina, estreptomicina, y anfotericina. El tumor fue mecánicamente extraído, lavado en PBS suplementado con antibióticos, y se centrifugó a 300 g durante 10 minutos. Las células cancerosas de DFTD se cultivaron en un medio de cultivo completo, compuesto de RPMI 1640, 10% de suero de ternera fetal, 2 mM de L-glutamina, y 40 mg/ml de gentamicina en un 5% de dióxido de carbono humidificado en una incubadora a 35 ° C. Las células tumorales de DFTD se analizaron visualmente para confluencia y se conservaron. Las células se mantuvieron en cultivo durante al menos 3 meses antes de los análisis citogenéticos.

Para la inoculación de células cancerígenas de DFTD, a un total de 17 ratones adultos se les inyectaron en el tejido subcutáneo del flanco superior derecha células tumorales viables de DFTD en un volumen de 200 µl de PBS estéril. Además, 7 ratones fueron inyectados con células viables recolectadas de masas originadas a partir del xenoinjerto creado previamente. Para investigar si el DFTD se podría desarrollar a partir de células no viables, a 7 ratones se les inyectaron con células tumorales DFTD no viables (inactivados por ciclos rápidos de congelación en nitrógeno líquido y descongelación en agua caliente). Para analizar más a fondo la transmisibilidad de DFTD, 9 ratones adultos fueron inyectados subcutáneamente con células tumorales cultivadas vivas.

Los ratones fueron sacrificados por asfixia con dióxido de carbono cuando las masas tumorales fueron de aproximadamente 1 cm 3. Una minuciosa autopsia completa se realizó en cada ratón, y los tejidos (masas tumorales enteras, riñón, pulmón, corazón e hígado) se recogieron y se fijaron en 10% de formalina tamponada durante al menos 24 horas. Los tejidos recogidos fueron procesados, incrustados en bloques de parafina, y se seccionaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se desparafinaron en xileno, rehidratadas a través de soluciones de alcohol graduadas para el agua, y se tiñeron con técnicas estándar de hematoxilina y eosina (HE).

Para confirmar que las masas tumorales fueran DFTD y para la detección de la presencia de metástasis de DFTD, se analizaron las masas tumorales y secciones de órganos de células que expresan periaxina, que es una proteína expresada por las células de Schwann y que ha sido propuesto como un marcador de diagnóstico específico para DFTD . Brevemente, se sometieron las secciones de tumor desparafinadas para calentar en buffer de citrato con una olla a presión durante 10 minutos y se dejó enfriar a 35 ° C. La actividad de la peroxidasa endógena se inactivó mediante se trataba las diapositivas de peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron previamente con solución de bloqueo libre de suero durante 30 minutos y después se incubaron con anticuerpo de conejo anti-periaxina durante 1 hora.

El cariotipo normal del demonio de Tasmania se compara con el cariotipo de las células tumorales cultivadas y células tumorales xenoinjertados. Para el cariotipo normal, se utilizaron los linfocitos de sangre periférica de un diablo de Tasmania hembra sana. La sangre periférica se cultivó en medio RPMI completo y se estimularon con fitohemaglutinina (5 mg/ml) durante 72 horas, mientras que las células tumorales de DFTD se cultivaron sin la necesidad de estimulación. Los cultivos de sangre periférica se sincronizaron con timidina (30 mg/ml) y 2-desoxicitidina (0,21 mg/ml) para maximizar el rendimiento de la metafase. Las células cultivadas se trataron con cloruro de potasio 0,075 M. Las láminas fueron preparadas con técnicas citogenéticas convencionales y las bandas G con tripsina.

REFERENCIAS

- A.M. Pearse and K. Swift. 2006. Allograph theory: Transmission of the devil facial-tumor disease, Nature. 439, pp. 549

- Catelló, C. (2013) Genómica comparativa: diseccionando el genoma del Cáncer Facial del Demonio de Tasmania, DFTD. Universidad Autónoma de Barcelona, Recuperado el 24 de Febrero de 2015 de: https://ddd.uab.cat/pub/tfg/2013/113427/TFG_claracastelloecheverria.pdf

- Fuchs, G. (2013) Desafíos de Ingeniería. Recuperado el 24 de Febrero de 2015 de:http://web.ing.puc.cl/~ing1004/Homeworks/SeresVivos_E3/g32_GabrielFuchs_SarcophilusHarrisii.pdf

- Hawkins et al. 2006. Emerging disease and population decline of an island endemic, the Tasmanian devil Sarcophilus