Electroforfesis

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**Véase en anexos la preparación de los reactivos usados que se mencionan en las tablas anteriores así como la preparación de los reactivos para la tinción.

Resultados:

Discusiones:

El gel de poliacrilamida se moldea entre dos hojas de vidrio mediante polimerización de una solución de monómeros de acrilamida en cadenas de poliacrilamida y al misma tiempo se crean enlaces cruzados que forman una matriz semisólida. El tamaño de poro de un gel se puede variar mediante ajustes en las concentraciones de poliacrilamida y del reactivo que forma enlaces cruzados. La velocidad a la cual una proteína se mueve a través del gel depende del tamaño del poro del gel y de la fuerza del campo eléctrico. Mediante el ajuste apropiado de estos parámetros, es posible separar proteínas de tamaños muy variables.

El SDS desnaturaliza las proteínas, haciendo que las proteínas multimericas se disocien en sus subunidades y todas las cadenas polipeptidicas son forzadas a adoptar conformaciones extendidas, con relaciones carga: masa similar. Así el tratamiento con SDS elimina el efecto de las diferencias de forma, por lo que la longitud de la cadena, que refleja la masa, es el único determinante de la velocidad de migración de las proteínas en la electroforesis en poliacrilamida con SDS.

La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS separa las proteínas únicamente sobre la base de su masa básicamente esta se puede dividir en tres pasos. El primero el tratamiento inicial con SDS, un detergente cargado negativamente, disocia las proteínas multimericas y desnaturaliza todas las cadenas polipeptidicas, el segundo durante la electroforesis, los complejos SDS-proteína migran a través de gel de poliacrilamida. En el último paso las proteínas más pequeñas son capaces de moverse a través de los poros con mayor facilidad y rapidez que las proteínas más grandes. En consecuencia, las proteínas quedaran separadas en bandas de acuerdo a su tamaño a medida que migran a través del gel. Pará observar estas bandas se tiñen.

Conclusión:

La electroforesis en gel separa las proteínas sobre la base de su velocidad de desplazamiento ante la aplicación de un campo eléctrico. La electroforesis en gel de poliacrilamida puede resolver cadenas polipeptidicas de tengan de diferencia el 10% de su peso molecular o menos existen otro tipos de electroforesis pero el fundamento de separación aplicando campos eléctricos es el mismo, el objetivo de esta práctica se cumplió con éxito al aprender e fundamento de esta técnica.

Bibliografía:

https://books.google.com.mx/books?id=YdyMSxY2LjMC&pg=PA87&dq=electroforesis&hl=es-419&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=electroforesis&f=false

Anexos

Preparación del Gel y Reactivos para la Electroforesis en Geles de SDS-Poliacrilamida

(SDS-PAGE) (Laemmli)

A) Acrilamida/Bis (30% T, 2.67%C)

Acrilamida 146.0 g

N’N 4.0 g

Bismetilenacrilamida 4.0 g

500 mL de agua destilada. Filtrar, guardar a 4°C en la obscuridad. Vida media 30 días.

B) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8

Tris base 54.45 g

Agua destilada 150 mL

Ajustar el pH 8.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 300 mL con agua destilada.

Almacenar a 4 °C

C) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8

Tris base 6.0 g

Agua destilada 60 mL

Ajustar el pH 6.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 100 mL con agua destilada y almacenar a 4°C.

D) 10% (w/v) SDS

Disolver 10 g de SDS en agua destilada, agitar suavemente y aforar a 100 mL

E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio

100 mg de sulfato de amonio. Adicionar 1 mL de agua destilada, preparar en el momento.

F) Buffer de corrimiento (5x), 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 1% de SDS, pH 8.3

Tris base 45.0 g

Glicina 216 .0 g

SDS 15.0 g

No incluir el SDS cuando se requiera hacer corrimiento bajo condiciones nativas (PAGE).

Aforar a 3 L con agua destilada. No ajustar el pH con ácido o base.

Almacenar a 4°C. Calentar a 37°C antes de usar en caso de precipitación.

G) Sample Buffer

Agua destilada 4.4 mL

0.5 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 mL

Glicerol 0.8 mL

10 % SDS 1.6 mL

0.5 (w/v) azul de bromofenol en agua 0.2 mL

Diluir la muestra por lo menos 1:4 con el sample buffer.

*Si el gel fuese en condiciones desnaturalizantes y reductoras, se deberá adicionar 0.4 mL al sample buffer de beta-mercaptoetanol y posteriormente de diluir 1:4 habrá que calentar las muestras a 95 °C por 4 min. *Cuando son condiciones nativas (PAGE) omitir SDS,

H) Preparación de PAGE-SDS 10%

Volúmenes requeridos para dos placas del sistema Mini-Gel BioRad MR

Gel Separador (Separating) (10 mL)

Agua destilada 4.0 mL

1.5 M Tris-HCl pH 8.8 2.5 mL

Acrilamida 3.3 mL

10 % SDS 0.1 mL

Persulfato de amonio 10% 0.1 mL

Temed 0.004 mL

Gel Concentrador (Stacking) (4mL)

Agua