Postcosecha.

...

Una vez identificadas las variedades a estudiar, se realizara un análisis in silico en búsqueda de genes en común, para ello mediante herramientas bioinformáticas se realizan alineamientos en regiones con un grado de conservación alta entre dichas variedades que participen en la resistencia. De no obtener la secuencia en su totalidad se ocupa la técnica de 5’ 3’ RACE con la cual conociendo un dominio conservado se puede obtener la secuencia del gen usando partidores poliA para el extremo 3’y adaptadores para obtener los extremos 5’, con la cual la secuencia obtenida se clona en un vector de secuenciación y el resultado obtenido se analiza mediante un nuevo alineamiento para la obtención se la secuencia completa del gen.

Una vez identificados los genes de interés entre las distintas variedades, se producen partidores que flanqueen estos genes, estos serán utilizados para la generación y amplificación de cDNA mediante RT-PCR, a partir del cual se podrá determinar una mayor o menor expresión de genes asociados a resistencia en las variedades. Todo esto se realizara a las muestras de RNA previamente extraídos desde el tejido total de fruto perteneciente a las cuatro variedades escogidas.

A partir del resultados de RT-PCR, se procederá a analizar los factores de transcripción que podrían estarían participando sobre dichos genes, para determinar esto es necesario un nuevo análisis bioinformático que dé cuenta sobre qué factores activan o reprimen dichos genes generando un modelo de regulación. Si fuese necesario se puede analizar además mediante Q-PCR la expresión de los genes de interés, ya que esta técnica utiliza una sonda unida a fluroforos que pueden ser detectados y cuantificados mediante el uso de software. Una vez que se hayan identificado los factores de transcripción activadores y represores se utiliza el ensayo EMSA en geles de retardo que identifican la unión de DNA-proteína, este ensayo podrá dar cuenta de si existe una interacción real de proteína-DNA en las secuencias de los genes identificados. Para comprobar aún más los resultados se puede realizar ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (Chip) que también se basa en la unión específica de DNA-proteína. Tanto para EMSA como para chip será necesario la construcción de anticuerpos específicos para su detección. Además se necesitara la purificación de los factores de transcripción que podrían encontrarse involucrados en la regulación transcripcional, esto se puede lograr mediante el uso de una cromatografía por afinidad, que se basa en interacciones biológicas altamente especificas con un ligando que se encuentra unido a una matriz insoluble.

Luego en las plantas susceptibles se agrega mediante transgénesis la inserción del factor de transcripción endógeno para lograr en el estadío de ripening y mature, la expresión de la resistencia. El constructo estará determinado por promotor inducible que mediante un estímulo en estado de ripening y mature genere la activación del gen que generará el factor de transcripción, para la selección de la planta que adquiera el vector, se utilizara una resistencia a algún antibiótico. Entonces, usando marcadores moleculares, SNPs que se han utilizado para variedades de Lapins y Regina, se identifica en nuestra variedad que sobre expresa factores de transcripción.

El transgénico será realizado por transformación por Agrobacterium ya que se ha revisado bibliografía en donde otras plantas del genero Prunus (Urtubia y cols. 20) han sido transformadas con el uso de este método. Lo primero que se generará es el vector, este deberá contener un promotor fuerte inducible especifico para fruto, marcadores de resistencias que permitan la selección para agrobacterium y para cerezo, un terminador de la transcripción, las secuencias derecha e izquierda del T-DNA, iniciador de la transcripción. El vector será generado mediante sistema gate way debido a su eficiencia y se multiplicara mediante PCR previo a su electroporacion.

La batería será transformada con el vector y se seleccionara mediante el uso de antibióticos, las bacterias transformadas serán usadas para la infección de cerezo sensible a craking.

Una vez infectadas las plantas, se seleccionaran las transformadas mediante el uso de antibióticos, se estudiara la correcta inserción del transgen y su numero de copias mediante PCR y southernblot respectivamente, para esto se usaran primers específicos para regiones flanqueantes al T-DNA. Las plantas transformadas de denominaran F1 y serán cruzadas entre ellas para obtener una F2 homocigota para el transgen, esta caracteristica se identificara mediante PCR y suthernblot.

Luego se analizaran la presencia de los RNAm de interés mediante técnicas de RT-PCR y nothernblot. También se medirán la concentración de proteínas mediante westernblot y ELISA usando anticuerpos específicos para los factores de transcripción.

finalmente se analizaran las resistencias al craking de las cerezas transgénicas mediante ensayos de exposición al agua.

- 4e.- RESULTADOS ESPERADOS:

El análisis bioinformática se esperaría que arrojara la existencia de grupos de genes asociados a resistencia relacionados con la pared celular del fruto como poligalacturonasa, pectinesterasa, expansina y β-galactosidasa, este último se ha visto que tiene regulación diferencial (Kovács y cols., 2008); genes relacionado con el control de osmosis; y genes que participen en permeabilidad de la cuticular. Estos genes estarían presente tanto en las variedades resistentes como en las suceptibles con un alto nivel de homología y un alto score en la base de datos utilizada.

Los genes los cuales solo se contenía un dominio conservado, para la generación de primers se obtendra la secuencia completa la cual fue secuenciará y alineará contra base de datos.

Los resultados de RT-PCR indicaran que genes que están en ambas variedades, tienen un expresión diferencial, dando como resultado mayor transcrito en variedades de cerezas resistentes y menor en la susceptible, lo cual mediante Q-PCR debiera arrojar la misma relación, resultado que indica que habra genes que se expresan diferencialmente en las distintas variedades de cerezas.

El análisis de factores de transcripción que actúan en los genes de interés están presente en base de datos, a partir de esto se fabricaran anticuerpos, y se realizara la purificación exitosa de dichas proteínas, el resultado de EMSA deiera indicar que para los genes de interés hay factores que se unen al DNA por lo que se genera el retardo, lo que se comprobara dicha unión DNA-proteína con Chip.

De