Extracción de Plásmido

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2. Investigue cómo trabaja el etanol en la precipitación de DNA. ¿Por qué después se lava con etanol al 70%?

El ADN es insoluble en presencia de Alcohol, así, al añadir Etanol el ADN precipita y lo podemos separar de la mezcla por centrifugación. Se añade o se lava con etanol al 70% ya que elimina algunos de las sales presentes en el sobrenadante sobrante y obligados a hacer que el sedimento de ADN limpiador final de ADN.

3. ¿cómo funciona el SDS en la solución de lisis?

El detergente SDS, se utiliza para romper los enlaces de las proteínas y lípidos enlazados a la membrana, mediante enlaces débiles, permitiendo la disgregación de la membrana; forma un complejo junto con otras sustancias para producir la lisis absoluta del plásmido.

4. ¿Cómo podría cuantificar la concentración del DNA?

El ADN se podría cuantificar mediante distintos métodos, entre ellos:

- Por el método de fluorescencia

Los ensayos que utilizan reactivos fluorescentes son más específicos que la absorbancia a 260 nm para cuantificar. El total de ADN de doble cadena (dsDNA) en una muestra de ADN. Recomendamos el uso de reactivos fluorescentes como PicoGreen® o SYBR® Green I para cuantificar el dsDNA, pues hay menos interferencia de ARN contaminante. Un protocolo económico que utiliza SYBR Green I se describe en PD-PR-075, DNA quantification using SYBR Green I dye and a micro-plate reader1. Como alternativa se pueden utilizar kits disponibles en el mercado como el kit de ensayo de dsDNA Quant-iT™ PicoGreen de Invitrogen (n.º de cat. Q-33130). Para cualquier protocolo recomendamos disolver el ADN purificado a 1:50 con solución de TE, y utilizar 5 µL en el ensayo de cuantificación.

- Por el método de absorbancia

Si se opta por la cuantificación de ADN por absorbancia, le recomendamos tratar en primer lugar la muestra purificada con RNasa para digerir el ARN contaminante y, posteriormente, eliminar los fragmentos de ARN mediante precipitación con etanol del ADN. Un protocolo detallado se describe en PD-PR-040, RNA removal by double-RNase digestion. Tenga en cuenta que el ADN de una muestra oral suele contener bastante más ARN que el encontrado en muestras de sangre. Asegúrese de que el ADN precipitado con alcohol este completamente disuelto antes de leer la absorbancia. Factor de conversión: Una absorbancia de 1,0 a 260 nm se corresponde con una concentración de 50 ng/µL (50 µg/mL) de dsDNA puro.

RESULTADOS

[pic 1]

Este es uno de los métodos de extracción de ADN más utilizados por su fácil implementación, baja toxicidad de sus reactivos y permite la visualización del ADN; gracias al rompimiento de la pared celular, disrupción celular, eliminación de las proteínas y la concentración del DNA por precipitación de alcoholes.

CONCLUSIONES

- Al finalizar este laboratorio pudimos extraer el DNA de un plásmido bacteriano, el cual se caracteriza por adoptar una conformación tipo doble hélice y no tiene proteínas asociadas. El DNA de los plásmidos no contienen información esencial, sino que confieren ventajas al hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. Los plásmidos se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética por su capacidad de reproducirse de manera independiente del DNA cromosomal.

- Entre la extracción de DNA cromosómico y el DNA de plásmidos podemos establecer ciertas diferencias, entre las más importantes se menciona:

- El DNA cromosomal posee más cantidad de nucleótidos para codificar todo tipo de proteínas que se necesite sintetizar, constituye la única molécula capaz de almacenar y transmitir la información genética hacia la descendencia, mientras que el plásmido es una pequeña molécula de ADN circular extracromosómico que posee un número limitado de nucleótidos y nunca puede transmitir la información genética del organismo.

- El DNA cromosomal se encuentra compactado, plegado y combinado con los componentes citoplasmáticos en una región nuclear primitiva sin membrana nuclear llamada nucleoide, mientras que el plásmido posee un peso molecular menor al ADN cromosomal y su forma es circular cerrada.

- El DNA cromosomal se replica en organismos procariontes en forma bidireccional iniciándose en un punto de iniciación y terminando en un punto de finalización dentro de la molécula del DNA, originando copias de DNA hijas idénticas al DNA progenitor. El plásmido se replica si no está integrado al cromosoma bacteriano en forma independiente en forma de un círculo rodante sincronizado con la duplicación del ADN cromosomal, si está integrado al cromosoma bacteriano lo hace pasivamente dentro del cromosoma una vez que éste se replica.

- El Plásmido F tiene como función formar en las bacterias que lo poseen finas prolongaciones llamadas pelos F o pili, importantes para la conjugación bacteriana, en tanto que el R tiene la función de hacer resistir a la pared celular bacteriana a 10 antibióticos diferentes porque posee como máximo 10 genes. Cada gen la hace resistir a un determinado antibiótico; en cambio, el DNA cromosomal solamente participa en la transmisión de los caracteres hereditarios de progenitores a la descendencia.

BIBLIOGRAFÍA

- Sambrook, J.; D. Russell. 2001. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3era edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 65 páginas.

Infografía

- Pérez, G. D. 2002. Purificación y análisis de DNA cromosómico bacteriano. http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/43%20PURIFICACI%C3%93N%20AN%C3%81LISIS%20DNA%20BACTERIANO.pdf

Dr. Alex Tan http://www.ehowenespanol.com/funcion-solucion-buffer-tris-extraccion-adn-sobre_43396/

ANEXOS

[pic 2][pic 3]

Microcentrigufa, utilizada para centrifugar.

Colocacion de los micro tubos para lograr balance

[pic 4]

Luego de centrifugación, este fue lo obtenido.

Se puede observar al pellet y la solución