La esterilización es la eliminación o la destrucción de todas las formas de vida microbiana.

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Tinciones diferenciales

A diferencia de las tinciones simples, las tinciones diferenciales reaccionan de modo diferente con las distintas clases de bacterias y por lo tan to pueden ser empleadas para estable establecer una distinción entre ellas. Las tinciones diferenciales utilizadas con más frecuencia para las bacterias son la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia.

Tinción de Gram

La tinción de Gram fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884 y es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas.

En este procedimiento

- Un extendido fijado con calor se cubre con un colorante violeta básico, por lo general violeta de genciana. Como el colorante violeta imparte su color a todas las células, se lo denomina colorante primario.

- Después de un breve lapso, se escurre el colorante violeta, se lava el extendido y se lo cubre con yodo, un mordiente. Cuando se lava el yodo, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas aparecen de color violeta oscuro o púrpura.

- A continuación se lava el portaobjetos con alcohol o con una solución de alcohol-acetona. Esta solución es un agente decolorante que elimina el color violeta de las células de algunas especies pero no de otras.

- Se elimina el alcohol con agua y se tiñe el portaobjetos con safranina, un colorante básico. Luego se vuelve a lavar el extendido, se lo seca con papel absorbente y se lo examina con el microscopio

El colorante violeta y el yodo se combinan en el citoplasma de cada bacteria y lo colorean de violeta oscuro o púrpura.

Las bacterias que conservan este color después de haberles agregado el alcohol para decolorarlas se clasifican como Gram positivas; las bacterias que pierden el color violeta oscuro después de la decoloración se clasifican como Gram negativas. Como las bacterias Gram negativas son incoloras después del lavado con alcohol, dejan de ser visibles. Por ese motivo se les aplica el colorante básico safranina, que las convierte en rosadas. Los colorantes como la safranina que tienen u n color que contrasta con el colorante primario se denominan colorantes de contraste. Dado que las bacterias Gram positivas conservan el colorante violeta original, no son afectadas por el colorante de contraste safranina.

[pic 6][pic 7]

Tinción de ácido-alcohol resistencia

Otra tinción diferencial importante (que diferencia bacterias en grupos distintivos) es la tinción de ácido-alcohol resistencia, que se fija de modo firme sólo a las bacterias que poseen ceras en las paredes de sus células. Los microbiólogos utilizan esta tinción para identificar a todas las bacterias del género Mycobacterium, que comprende dos patógenos importantes; Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis, y Mycobacterium leprae, el agente causal de la lepra. Esta tinción también se utiliza para identificar las cepas patógenas del género Nocardia.

Tinciones especiales

Las tinciones especiales se utilizan para colorear y aislar partes específicas de microorganismos, como endosporas y flagelos, y para detectar la presencia de cápsulas

Tinción negativa para cápsulas

La tinción de la cápsula es más difícil que otros tipos de procedimientos de tinción porque los materiales capsulares son hidrosolubles y pueden desprenderse o eliminarse durante los lavados rigurosos. Para demostrar la presencia de cápsulas el microbiólogo puede mezclar las bacterias en una solución que contenga una suspensión coloidal fina de partículas coloreadas (por lo general tinta china o nigrosina) que proporcione un fondo que contraste y luego teñir las bacterias con un colorante simple, como la safranina.

Tinción para endosporas (Esporas)

La más utilizada para este fin es la tinción de Schaeffer-Fulton para endosporas. Se aplica el colorante primario verde de malaquita a un extendido fijado con calor y se lo calienta hasta la emisión de vapores durante alrededor de 5 minutos. El calor ayuda a que el colorante atraviese la pared de la endospora. Luego se lava el preparado con agua durante cerca de 30 segundos para eliminar el verde de malaquita de todas las partes de las células salvo las endosporas. A continuación se aplica sobre el extendido safranina, un colorante de contraste, para teñir las porciones de la-célula distintas de las endosporas. En un extendido preparado de modo adecuado las endosporas aparecen verdes dentro de células rojas o rosadas. Como las endosporas presentan un índice de refracción alto se las puede detectar con el microscopio óptico cuando no están teñidas pero no se las puede diferenciar de las inclusiones de material reserva sin una tinción especial.

Tinción para flagelos

Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción demasiado pequeñas para ser vistas con un microscopio óptico sin tinción. Hay un procedimiento tedioso y delicado que se basa en el empleo de un mordiente y el colorante carbolfucsina para aumentar los diámetros de los flagelos hasta que se tornen visibles con el microscopio óptico. Como ayudas diagnósticas adicionales los microbiólogos utilizan la cantidad y la disposición de los flagelos.

Tabla 1. Tipos de tinción y su uso[pic 8]

Bacterias Gram negativas:

Bacterias que pierden el colorante violeta cristal después de la decoloración con alcohol; se tiñen de rojo tras el tratamiento con safranina.

Bacterias Gram positivas:

Bacterias que retienen el color violeta cristal tras la decoloración con alcohol; se tiñen de púrpura oscuro.

Aislamiento de bacterias

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener