Manejo y uso del microscopio.

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En 1932 Frits Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.

La microscopia de contraste nos dan la posibilidad de observar células vivas y sin ninguna preparación, ya que al realizar otros procedimientos existe la posibilidad de que algunos de sus componentes puedan perderse o distorsionarse por métodos como la fijación, coloración, congelación, y otros, así, estos instrumentos ópticos ayudan a resolver el problema.

La luz transmitida a través de las células vivientes, sin embargo, encuentra a su paso, regiones de índices de refracción diferentes, y diferentes grosores y/o densidades, lo que es capaz de alterar su velocidad y su dirección. En la Figura 1 se da la representación esquemática en donde dos regiones adyacentes de una misma célula, A y B, de un diferente grosor, t1 y t2 y con diferentes índices de refracción, n1 y n2, son atravesadas por un rayo luminoso. Las variaciones en grosor e índices de refracción son capaces de producir una diferencia en el curso óptico de la luz transmitida por las dos regiones. En este caso específico, le toma más tiempo pasar a la luz a través de la fracción B, cuyo índice de refracción es mayor (n2) y por lo tanto está retrasada la onda del rayo en velocidad con respecto al que es capaz de atravesar la porción A, cuyo índice de refracción es más bajo.

Si la diferencia de los índices de refracción es pequeña, la magnitud del cambio de fase inducido igualmente es muy pequeña y se mide en términos de longitudes de onda (l). Así, en la representación de la Figura 1, el rayo que pasa a través de la parte B se muestra retrasado 1/4 de longitud de onda ( l/4) y emerge fuera de fase. con respecto a la transmisión que nos muestra la parte A. (Javeriana)

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Figura 1. (Javeriana)

- Campo claro:

En campo claro toda la luz desde el espécimen y sus alrededores es colectada por el objetivo para formar una imagen contra un fondo brillante.

El campo claro es la forma más simple de microscopía donde la luz pasa a través de o reflejada del espécimen. La iluminación no se altera por aditamentos que cambien las propiedades de la luz (como polarizadores o filtros).

En aplicaciones biológicas, las observaciones de campo claro son usadas ampliamente para tinciones o pigmentos naturales o especímenes altamente contrastados montados en un porta objetos. El espécimen es iluminado desde abajo y observado desde arriba. El espécimen aparece brillante, pero más oscuro que el brillante fondo. Esta técnica es ampliamente usada en patología para ver secciones de tejidos fijos o películas celulares/frotis. El campo claro no es muy útil para células vivas sin teñir o secciones de tejido sin teñir, como en la mayoría de los casos, la luz pasa a través de muestras transparentes o traslucida con poca o sin definición de la estructura.

La luz es reflejada desde muestras opacas y esto es explotado en los ambientes industriales donde las imágenes de campo claro son usadas para la inspección de obleas (WAFERS) y tarjetas de cristal líquido.Todos los microscopios son capaces de obtener imágenes de campo claro. (Anonimo)

- Campo oscuro:

El microscopio de campo oscuro se encuentra catalogado entre los microscopios ópticos.

Desde muchos años atrás el microscopio óptico posibilito el descubrimiento de las células y la elaboración de la teoría de que todos los seres vivos están constituidos por células. El microscopio de campo oscuro está constituido por un microscopio óptico al cual se le acondiciona un condensador especial, este tiene como fin producir una disfracen de los rayos luminosos enviándolos lateralmente sobre el objeto en forma de un cono luminosos, y de esta forma tampoco penetran directamente al objetivo. Existen dos clases de condensador oscuro:

- Cardiode

- Paraboloide.

Ambos son utilizados con el mismo fin, pero el cardiode tiene mayor aplicabilidad en la investigación con Treponemas.

Para que el efecto de campo oscuro se logre, la apertura numérica del condensador debe ser mayor que la del objetivo, lo cual ocurre con los objetivos de pequeño y gran aumento no así con los de inmersión los cuales deberán adicionarse de un diagrama de suspensión para la reducir la apertura numérica. (Gerhardt, 1994)

Las ventajas de este campo se mencionaran a continuación:

- Permite ver partículas dispersas en un medio homogéneo.

- Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas.

- Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear.

- Visualiza los bordes destacados delas muestras.

- Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum, espiroquetas con diámetros superior a 0.2 um. (Javeriana)

- Microscopia electrónica de barrido:

En el microscopio electrónico de barrido, un campo magnético permite enfocar los rayos catódicos (electrones) y obtener una imagen tridimensional, por el examen de la superficie de las estructuras, permitiendo la observación y la caracterización de materiales orgánicos e inorgánicos, proporciona aumentos de 200.000 diámetros.

Von Ardenne, en 1938, construyó el primer Microscopio Electrónico de Barrido (MEB); posteriormente, en Inglaterra, se construyó el primer MEB Ambiental, con el cual se pueden observar muestras hidratadas. Las partes del MEB se nombraran a continuación:

- Cañón de electrones (e-).

- Filamento de tungsteno o de hexaboruro de lantano-LaB6.

- Ánodo.

- Columna en vacío.

- Lentes condensadores (centran y dirigen el rayo de electrones).

- Lentes Objetivas (controlan la cantidad de electrones del haz).

- Detectores para colectar y medir electrones (producción de imagen).

- Bobinas de barrido (obligan al haz a barrer la muestra).

- Control de aumento.