Que es la Inmunohistoquímica

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- La cantidad de antígeno disponible.[pic 2]

- La cantidad de anticuerpo o antisuero que se necesita.

- La relación filogenética entre las especies de origen del antígeno y la especia usada para obtener el antisuero.

- Uso que se le dará a los anticuerpos.

Con respecto a la vías de inoculación, tenemos la via intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal (en el caso del ratón) e intravenosa.

Entonces, los Ac policlonales, se obtienen mediante la introducción del antígeno deseado en el animal de experimentación, de forma que desencadena la respuesta inmune y la proliferación de diferentes clones de linfocitos B que reconocerán de forma específica cada uno de sus determinantes antigénicos. Una vez realizado todo el proceso, se extrae la sangre del animal, de la cuál obtendremos el suero donde se encuentran los Ac dirigidos al Ag con el que se realizó la inmunización (frente a todos los determinantes antigénicos) y también frente a otros Ag a los que se haya expuesto el animal previamente.

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Por otro lado, la obtención de Ac monoclonales, se consigue mediante la inmunización de un ratón con el Ag deseado y transcurrido un cierto tiempo, se extrae el bazo y se disgrega para obtener linfocitos B, que se fusionan con células de mieloma que presentan deficiencia en la enzima hipoxantina guanina fosfo ribosil transferasa (HGPRT) implicada en la síntesis exógena de ADN. Esta unión (célula de mieloma- linfocito B) se conoce como hibridoma, que es cultivado en un medio selectivo HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). La aminopterina bloquea la vía endógena, y sólo las células que puedan sintetizar ácidos nucleicos por la vía exógena (que sean HGPRT+) sobrevivirán. Los hibridomas formados por la fusión entre un linfocito y una célula de mieloma son capaces de crecer en este medio. A continuación se analizan los pocillos por Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay), acuñado por Eva Engvall y Peter Perlmann, investigadores suecos que describieron el procediemiento en 1971. “Se trata de un método analítico que depende de la reacción Ag-Ac”. Además Dr. Elena González Rey, del Instituto de parasitología y biomedicina Lopez Neira, explica: “que se trata de una técnica bioquímica que permite detectar y cuantificar sustancias en distintos tipos de disolución”. Para ello se utiliza una placa de microtitulación donde se llevan a cabo incubaciones y reacciones necesarias, cuyo material es especial ya que permite la adhesión de proteínas al mismo. Las placas deben ser previamente sensibilizadas con Ac, de forma que fijaremos los pocillos con Ac (por ejemplo de necrosis tumoral) a una concentración adecuada durante toda la noche y a una temperatura de 4º, de forma que los Ac quedan fijados a los pocillos y aquellos que no se hayan quedado unidos a la placa, se eliminan con el sobrenadante y se realizará tres lavados con un tampón PBS para la correcta eliminación de Ac que no se hayan adherido adecuadamente. A continuación se rellenan los pocillos con la solución de bloqueo, PBS + BSA (albúmina sérica bovina), que debe ser incubada por 2´ a temperatura ambiente, esto permite rellenar los espacios que los Ac 1º han dejado entre sí, de forma que en otras incubaciones no se produzcan uniones inespecíficas. A continuación se añade, la muestra problema (soluciones de diferente concentración) rellenando dos pocillos con la misma muestra problema y luego otros dos con otra de diferente concentración hasta rellenar los pocillos de interés y se incuba a 4º durante 12´, tras las cuales se retira el exceso de muestra que no se ha único a la placa y se añade el Ac 2º que es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente y se une al Ag de la muestra y al Ag de concentración conocida de la curva estándar. Se realizan 6 lavados con el fin de eliminar el Ac 2º que estaba unido a u una reacción colorimétrica en función de la cantidad de Ag presente en la muestra, y se incuba a temperatura ambiente cubriéndolo, con el fin de que el proceso final sea en la oscuridad.

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Éste método de ELISA, es el conocido como directo o “sándwich”, sin embargo el método ELISA se clasifica en:

- ELISA no competitivo; consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la fase sólida. Si un muestras es positiva, se formará el complejo Ag-Ac, y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollandocolor.

- Directo detectan Ag.[pic 5]

- Indirecto detectan Ac.[pic 6]

- ELISA Sandwich; muy utilizado en la técnica para la obtención de Ac monoclonales.

- ELISA competitivo; el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

Entre las diferencias que presentan los Ac monoclonales y policlonales, destacamos:

AC POLICLONALES

AC MONOCLONALES

VENTAJAS

VENTAJAS

- Afinidad: al tratarse de varios anticuerpos que reconocen distintos epítopos de una misma proteína, presentan una alta afinidad por el antígeno, lo que permite amplificar la señal en el caso de proteínas con bajos niveles de expresión o que se encuentren en bajas cantidades en la muestra a analizar.

- Tolerancia a cambios en el antígeno: al reconocer distintos epítopos, son mucho menos sensibles a pequeños cambios que puedan ocurrir en la proteína diana.

- Robustez: debido a su capacidad para unirse a distintos epítopos de la proteína diana, los resultados obtenidos con anticuerpos policlonales suelen ser más robustos.

- Producción: el proceso de producción de anticuerpos policlonales es relativamente rápido y sencillo, implicando un menor coste.

Especificidad: Al reconocer un único epítopo, su especificidad es mayor, reduciendo la probabilidad de reacciones cruzadas y el ruido de fondo en los ensayos.

Reproducibilidad: No presentan variabilidad entre lotes, por lo que si las condiciones de un determinado ensayo se mantienen constantes, los resultados son altamente