TÉCNICAS BIOQUÍMICA

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Extracción y purificación de moléculas biológicas

La extracción supone un tratamiento mecánico del tejido en un medio líquido tamponado. La homogenización puede ser total (tratamiento enérgico) o limitada (tratamiento suave).

Para la homogenización total se emplean morteros de cerámica, mezcladores de cuchillas, como batidoras, o bien homogenizadores de émbolo, empleados con cultivos celulares o para mejorar la extracción realizada con los sistemas anteriores. Los politrones combinan la rotación de cuchillas con la creación de vacío y ultrasonidos. Dan extractos muy finos.

La homogenización limitada se consigue mediante ensayo y error. Se ajustan las condiciones para obtener el rendimiento deseado. Requiere una puesta a punto.

Para obtener células a partir de un tejido se emplea la digestión enzimática, por ejemplo para obtener protoplastos a partir de tejido vegetal (celulasa). Es un proceso más lento y más caro que la homogenización.

Características del medio de extracción

Ha de ser similar en lo posible al medio fisiológico de la macromolécula a estudiar. Debe tener un carácter protector frente a la oxidación, la reducción y a las proteasas. Debe estar tamponado, con un pH cercano al fisiológico. La fuerza iónica ha de ser la adecuada, la presión osmótica es importante si se trabaja con orgánulos. Se puede ajustar con sacarosa o glicerol.

La temperatura nunca es similar a la fisiológica, suele estar en torno a los 4ºC para ralentizar las reacciones de oxidación, las proteasas...

Se usan agentes reductores para prevenir la oxidación por el aire. Ejemplos son el bisulfito, el 2-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT).

Para prevenir la proteolisis se añade una proteína exógena, como la BSA, en mayor concentración que las proteínas del extracto. Actúa como un sustrato que "distrae" a las proteasas.

También existen inhibidores de proteasas. Pueden ser competitivos, dado que unen el centro activo, como la leupeptina o la antipaína. También los hay químicos, menos selectivos, como el EDTA, que quela los metales del centro activo.

Separación

-Mediante precipitación selectiva: puede ser por precipitación ácida, salina o con polímeros o disolventes orgánicos.

Precipitación ácida: tricloroacético (TCA), perclórico. El TCA desnaturaliza las proteínas, en cambio el perclórico no.

Precipitación salina: sulfato amónico, no desnaturalizalas proteínas a concentraciones bajas.

Polímeros o disolventes orgánicos: polietilénglicol (PEG). No es desnaturalizante. Etanol y acetona, sí desnaturalizan. El etanol se utiliza para precipitar ácidos nucleidos.

-Mediante diálisis: se emplean membranas cuyo tamaño de poro permiten el paso de micromoléculas e impiden el paso de macromoléculas. También sirve para cambiar el tampón de la muestra. Se emplean volúmenes de tampón de dos a cuatro órdenes de magnitud mayores que el de la bolsa de diálisis que contiene la muestra, lo cual se consigue haciendo diálisis sucesivas. Es un proceso muy lento durante el cual se va perdiendo la actividad de los enzimas.

Purificación

Las proteínas se purifican por sus diferencias en cuanto a tamaño, carga y forma.

La resolución es la capacidad de una técnica para separar moléculas en función de la magnitud del parámetro físico por el que se están separando; si la diferencia es pequeña se necesitará mucha resolución.

En cuanto a la cantidad de muestra, hay técnicas preparativas, que procesan mucha cantidad, y técnicas analíticas, que pueden procesar muy poca muestra pero son mucho más resolutivas que las técnicas preparativas.

Durante la purificación se emplean métodos identificativos, para saber en qué fracción está la molécula de interés, por ejemplo, un ensayo de actividad enzimática. Así, tendríamos una sucesión de fases fraccionamiento-identificación-fraccionamiento...

Hay dos parámetros que indican si el método de purificación es adecuado:

-Porcentaje de recuperación: es el % de la molécula de interés que se recupera tras cada paso de purificación. Disminuye a lo largo del proceso. Sirve para evaluar las pérdidas.

Actividad enzimática de una fracción x 100 /actividad enzimática del extracto crudo

-Factor de purificación: aumenta durante el proceso

[proteína de interés/proteína total]paso i / [proteína de interés/proteína total]extracto crudo

Espectroscopía de absorción.

La espectroscopía permite el estudio de la absorción y la emisión de radiación electromagnética por la materia. La luz consiste en ondas electromagnéticas que viajan por el espacio a una velocidad de