CIENCIAS DE LA SALUD. La Criminalística

...

A las pruebas que se realizan para determinar si la sangre es o no humana, se les denomina en general, diagnóstico de especie. Los métodos utilizados se basan en la reacción de precipitación que se produce entre los antígenos y los anticuerpos. Las técnicas más comunes son: la reacción de UHLENHUTH, el Test de OUCHTERLONY.

TECNICA DE UHLENHUTH

La técnica de elección para determinar si una mancha de sangre es de origen humano, es la reacción de las precipitinas descubierta en 1900 por Uhlenhuth.

Fundamento de la técnica Las moléculas del anticuerpo (inmunoglobulina) reacciona con el antígeno (proteína soluble) para formar un precipitado fácilmente visible bajo condiciones de luz apropiadas y a las concentraciones equivalentes de antígeno y de anticuerpo. Esta reacción antígeno-anticuerpo está influida por varias fuerzas, interactuando entre los factores reaccionantes como lo son: las fuerzas de Van der Walls, puentes de hidrógeno, interacción de dipolos, atracción entre los antígenos no polares y la superficie del anticuerpo, y la atracción electrostática. La reacción misma tiene lugar en varias etapas. Inicialmente se forma un complejo antígeno- anticuerpo soluble; conforme la reacción prosigue, ese complejo empieza a unirse y forma una tupida red compuesta de moléculas de anticuerpo bivalente y moléculas de antígeno polivalente. Esta Formación crece rápidamente formando partículas del tamaño suficiente como para ser insolubles y formar un precipitado visible. Debe tenerse en mente que para que la reacción se lleve a cabo se requiere que la concentración del antígeno y del anticuerpo sean equivalentes. La técnica de precipitinas en tubo o en capilar, tiene la ventaja de ser rápida y sencilla pero es necesario tener una muestra clara. En ella debe efectuarse una cuidadosa estratificación en donde la capa de la solución del antígeno se encuentra sobre la preparación del anticuerpo. La precipitación sobre gel tiene una ventaja de poder realizarse con el extracto de una mancha de sangre aunque éste sea turbio, y requiere de muy pequeña cantidad de muestra, pero tiene como desventaja el emplear varias horas para que se efectúe la difusión. La técnica electroforética, tiene la ventaja de acelerar la difusión sobre el gel y por lo tanto disminuye el tiempo de reacción además de ser más sensible que las otras técnicas, pero requiere de un equipo más costoso.

TECNICA DE UHLENHUTH

Factores que afectan la reacción de las precipitinas. Son varios: la edad de la muestra; su exposición al aire, a la luz solar, a la humedad y a las altas temperaturas; el grado de putrefacción y la contaminación con compuestos químicos, tales como detergentes. 19 Además la reacción debe efectuarse en condiciones óptimas de temperatura, de pH, de solubilidad de la muestra y de dilución del extracto obtenido de ella. Especialmente la edad y la putrefacción causan degradación de las proteínas de la sangre; la exposición al aire, a la luz solar y a la humedad a menudo produce cambios por oxidación. El extracto de la mancha de sangre debe tener un pH casi neutro y la prueba debe llevarse a cabo a la temperatura del laboratorio (aproximadamente 22 °C) Los extractos deben prepararse en el menor volumen posible, procedimiento que para algunas muestras requiere de 24 hrs. en refrigeración. El tiempo adecuado dependerá de las condiciones de la muestra y el título de dilución deberá ser de 1 a 1,000.

TEST DE OUCHTERLONY

La inmunodifusión doble de Ouchterlony es un método inmunológico sencillo y rutinariamente usado en el laboratorio clínico para la detección de antígenos o anticuerpos en una muestra biológica. Es considerado el proceso estándar para la detección de Antígenos Nucleares Extraíbles (ENA).

Procedimiento: Sobre una placa con gel se corta una serie de hoyos con atención a la geometría entre un hoyo y los demás. Se coloca un extracto de células humanas (extraídas de tejido de las amígdalas) en el pocillo del centro. Este extracto contiene un cóctel de antígenos humanos naturales que se quiere obtener. El suero sanguíneo del paciente es colocado luego en uno de los pocillos exteriores y la placa se deja por 48 horas para su revelado. Durante este tiempo, los antígenos de las amígdalas y los anticuerpos en el pocillo del suero migrarán de manera radial hacia afuera de sus respectivos pocillos. Al encontrarse ambos a mitad de camino y, de haber anticuerpos en contra de los antígenos tonsilares, se unirán en una red de enlaces llamado complejo inmune, el cual precipita en el gel revelando una línea blanquecina.

TEST DE OUCHTERLONY

Principio: La precipitación ocurre con la mayoría de los antígenos, debido a que éstos tienden a ser multivalente, es decir, tienen varios determinantes antigénicos por molécula, al que los anticuerpos pueden enlazarse. Cada anticuerpo, a su vez, tiene por lo menos dos sitios de unión para los antígenos, de modo que se entrecruzan formando una gran matriz de agregados antígeno: anticuerpo.

Experimentalmente, una cantidad de antígeno se añade de manera incrementada a una cantidad constante de anticuerpo en solución. Inicialmente, a una baja concentración, todo el antígeno participa en el precipitado, lo cual se conoce como una zona de exceso de anticuerpo o fenómeno de prozona.

A medida que se añade más antígeno, la cantidad de proteína que precipita, aumenta hasta que las moléculas de antígeno: anticuerpo alcanzan una proporción óptima, llamada zona de equivalencia.

La zona de exceso se logra cuando la concentración del antígeno excede a la de los anticuerpos, y la cantidad de precipitación disminuye.

Interpretación: El precipitado que se forma al combinarse el antígeno con los anticuerpos pueden forman una línea continua llamada identidad completa, una línea continua con un espolón en un lado llamado línea de identidad parcial, o bien dos líneas que se entrecruzan llamadas líneas de no-identidad. El tipo de línea que se forma dictará si el paciente tiene alguna forma del anticuerpo que puede estar asociado a un proceso de enfermedad.

COMO ESTABLECER UN GRUPO SANGUINEO

Los grupos sanguíneos son los distintos tipos en que se clasifica el tejido sanguíneo. Fueron descubiertos por Karl Landsteiner en el año 1901, quien los agrupó de acuerdo a la presencia o no de aglutinógenos en la membrana plasmática de los glóbulos rojos. En los humanos existen los aglutinógenos A y B. Por otra parte, en