Cromatografia por intercambio ionico

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Cálculos

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Figura 1. PERFIL DE ELUCIÓN DE LA SEPARACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS

DISCUSIÓN

Tabla 2. pKa de los aminoácidos a separar.

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Teóricamente, la prolina es el primer aminoácido en eluir y en salir de la columna, esto se hace evidente cuando revelamos con ninhidrina los primeros tubos en revelar un aminoácido toman una coloración amarilla, lo que indica la presencia de prolina y poco a poco los tubos se ven de una tonalidad violeta, sabiendo que el último aminoácido en eluir es la histidina; sin embargo en la figura 1 podemos observar que estos aminoácidos no se separaron totalmente. En la gráfica no se pueden encontrar máximos sino hasta el final que, al parecer, es la máxima absorbancia de la histidina. Es probable que en algún pico se encuentre la máxima absorbancia de la prolina, pero no es posible visualizar ya que este aún no se separaba por completo de la histidina.

El posible error cometido en la práctica y posible causa por la cual no se separaron los aminoácidos es la velocidad de elución; este factor es importante para que a la velocidad en que se eluya no sea demasiado alta para así permitir que el ion pueda ser sustituido en su totalidad y no solo un parte de este, quedando retenido en el intercambiador y a una velocidad baja el tiempo de la separación sería demasiado. Así que el regular la velocidad permitirá obtener una buena separación.

Este tipo de cromatografía por intercambio iónico se basa en la separación de las moléculas en base a la carga con la que cuentan. Para la esta práctica se utilizó un intercambiador catiónico débil (amberlita IRC-50) que tiene como ion fijo al COO- y como ion móvil al H+, que al ser previamente resuspendida en regulador de citratos 0.1 M pH 5.25 se intercambió el H+ por el ion Na+, ya que este se encuentra en alta concentración. Para la separación de los aminoácidos es importante saber que estos están en su forma zwitterion ya que, como se muestra en la tabla 2, necesitamos conocer el pKa del grupo carboxilo, amino y el grupo R de cada aminoácido. A pH de 5.25 ambos aminoácidos tienen carga positiva con la diferencia de que la histidina tendrá 2 grupos cargados positivamente uno es el grupo amino y otro es el de su cadena lateral imidazol, ya que el pKa de la histidina para el grupo amino es de 6.0 y para el grupo imidazol es de 9.2, estos valores nos indican que a pH por debajo de 9.2 tendrá el grupo imidazol con carga positiva y a pH por debajo de 6 tendrá al grupo imidazol y al amino cargado positivamente, mientras que la prolina solo tiene uno que es el grupo amino del esqueleto del aminoácido cuyo pKa es de aproximadamente 10.60, esta diferencia hace que la histidina sea más positiva por lo que quedara unida al ion fijo del intercambiador liberando al Na+ que ocupaba ese lugar, posteriormente al cambiar el pH a 2 significara que habrá mayor cantidad de protones aumentando así la concentración de iones H+ que desplazaran a la histidina del intercambiador permitiendo su elución.

Otro factor que pudo influir sobre los resultados obtenidos es el tiempo de incubación con la ninhidrina, la cual pudo llevarse por más del tiempo necesario con lo cual se evaporo el diluyente de la ninhidrina que era etanol, produciendo la disminución del volumen con lo que se podría obtener una absorbancia diferente al estar hasta cierto punto más concentrada la muestra por la evaporación.

CONCLUSIÓN

La separación de la mezcla de histidina y prolina no se realizó de manera eficiente.

Existen varios factores a considerar para usar este método de separación, como es el empaquetamiento, el control del volumen de la columna y la velocidad de elución, así como el tiempo de incubación con la ninhidrina.

BIBLIOGRAFÍA

Donald Voet,Judith G. Voet. Bioquímica (2004) Editorial medica Panamericana, 3ra edición. Montevideo, Uruguay. Pág. 142-143.