QUIMICA ANALÍTICA III Práctica: Cromatografía de Intercambio Iónico

...

Aplicación de la muestra ⎯ A la columna se le agregará 2 ml de la solución proteica. Esto hace 4 mg de proteína y toda deberá unirse a la celulosa. Se colectarán fracciones de 3 ml en tubos de 18 X 150 inmediatamente después de haber aplicado la muestra de proteína. El volumen de la columna es de aproximadamente 5 ml, de tal manera que después del primer tubo no debemos de detectar la presencia de proteína a 280 nm. Constantemente se agregará buffer de fosfato de sodio 0.01 N, pH 7, de forma manual y se colectarán fracciones de 3 ml en tubos de 18 × 150. No debe secarse la columna, constantemente tiene que vigilarse y agregar buffer mientras se requiera.

Elución de la proteína ⎯ Se preparará buffer de fosfato de sodio 0.01 M, pH 7, conteniendo NaCl 0.2 M. Agregar a la columna manualmente. Colectar fracciones de 3 ml (aproximadamente 6-8 fracciones). En el segundo tubo es cuando debe de detectarse la presencia de proteína. Leer A280 de todas las fracciones colectadas. Medir el volumen acumulativo de las fracciones (en una probeta de 100 ml se agregará el contenido de cada uno de los tubos registrando el volumen acumulado).

Presentación de resultados ⎯ Elaborar una gráfica de A280 contra volumen de elución (ml). Prepare un reporte breve sobre cromatografía de intercambio iónico en donde se incluya información sobre la separación de proteínas con intercambiadores catiónicos y aniónicos. Se deberá incluir información sobre las proteínas seleccionadas (gráficas, condiciones experimentales, intercambiador empleado, descripción de la propiedad funcional de la proteína –enzima, sustrato, cofactor, etc.). Preparar una presentación por equipo. Reporte la bibliografía apropiadamente.

Bibliografía

Deutscher M.P. 1990. Guide to Protein purification. In: Methods in Enzymology. Vol. 182. Academic Press, Inc. New York.

Whitaker J. and Bernhard R.A. 1981. Experiments for an introduction to enzymology. The Whiber Press, Davis, CA.