EXTRACIÓN DE ADN, ARN Y ADN PLASMIDICO, E IMPORTANCIA DE SUS TECNICAS MOLECULARES PARA LA INVESTIGACIÓN

...

Observando el procedimiento, y los resultados obtenidos, se puede deducir que un paso fundamental para la obtención de ADN y ARN, es la ruptura de las células o lisis celular, ya que hace que los ácidos nucléicos, puedan ser extraídos y separados al momento de la centrifugación. Según (Jiménez, 2003), la lisis celular es fundamental ya que las células animales están unidas por una membrana celular semipermeable. En el interior de ésta, los orgánulos están suspendidos en un líquido llamado citoplasma. La membrana celular puede romperse por medio de lisis, mecánicamente, químicamente o por alguna combinación de los dos. Para realizar la lisis química, las células se suspenden en una solución que contiene detergentes y otros reactivos que interfieren con los enlaces químicos que sostienen las proteínas de las membranas juntas. Esto resulta en la rotura de la membrana y la liberación de los componentes intracelulares.

En relación con esto, se pudo observar que el trizol es fundamental en el proceso de lisis celular ya que permite el rompimiento de la membrana plasmática haciendo así, que el proceso llevado a cabo sea eficaz. De acuerdo con la literatura, el trizol es un reactivo utilizado en el aislamiento de ARN de células y tejidos. Es una solución mono-fásica de fenol e isocianato de guanidina que durante la homogenización o lisis de la muestra mantiene la integridad del ARN, al mismo tiempo que altera la estabilidad de las células y disuelve los componentes celulares. La adición de cloroformo seguida de centrifugación separa la muestra en dos fases, una de ellas acuosa y la otra orgánica, el ARN permanece exclusivamente en la fase acuosa y puede ser recuperado por precipitación con alcohol isopropílico. Una vez removida la fase acuosa el ADN y las proteínas en la muestra pueden ser recuperadas por precipitaciones secuenciales de la misma (Ulloa et.al., 2007).

De acuerdo a lo dicho anteriormente, otro componente fundamental en la extracción de ADN y ARN, es el cloroformo, que según lo observado, permite la separación de la fase acuosa y la fase orgánica de la muestra. De acuerdo a la literatura, la desproteinización, se lleva a cabo con solventes orgánicos tales como el fenol y el cloroformo, los cuales tienen la propiedad de desnaturar proteínas. Al cloroformo, se le adiciona alcohol isoamílico con el fin de prevenir la producción de espuma y facilitar la separación de la fase acuosa y la fase orgánica (Puerta & Uruena, 2005)

La separación de fases, se dio gracias a un proceso fundamental en la separación y extracción de ácidos nucléicos. Este proceso se conoce como centrifugación. Después de la primera centrifugación, se notó que el ADN, el ARN y los restos de células y proteína, se encontraban separados. Se dedujo que dicha separación se dio de acuerdo a la densidad de cada uno de los compuestos encontrados en la muestra. Según (Koolman & Röhm, 2004), en una solución las partículas con densidad mayor se sedimentan, y en cuanto esta se hace menor, flotan. Con el fin de aprovechar las pequeñas diferencias de densidad para la separación de distintas sustancias en una solución, se puede utilizar la fuerza de atracción de la tierra ejercida en una centrífuga en la que se pueda aplicar la fuerza de centrifugación, varias veces mayor que esta.

El método de purificación es empleado para eliminar del ADN fragmentos de proteínas y ARN que persisten en la misma. La eliminación de este tipo de residuos es necesaria para obtener una completa purificación del ADN para su posterior análisis (Phillips-Mora et al., 1995).

La obtención de ADN íntegro y puro es una parte fundamental para el buen desempeño de las técnicas utilizadas en biología molecular (Tang et al. 2005, Wang et al. 2005). Una de las ventajas de utilizar métodos tradicionales es su bajo costo, así como un alto rendimiento. Sin embargo, en ocasiones el material obtenido está fragmentado. Estos métodos son susceptibles de contaminación, variación y errores por los múltiples pasos de manipulación (Störmer et al. 2007)

Durante el proceso de preparación del coctel de PCR, agua destilada estéril. Observando la manera hermética en la cual este proceso se llevó a cabo, se dedujo que el agua destilada estéril, se usó para no contaminar la muestra en preparación durante la PCR.

Según (Osorio et al., 2009), el proceso debe realizarse con reactivos puros, que no contaminen la práctica y libren de ADNasas a la mezcla, previniendo así, la degradación del ADN a amplificar, con lo cual, se puede corroborar que es importante, que no solo el agua esté completamente estéril, sino que cada reactivo que intervenga en la práctica, esté libre de agentes contaminantes que puedan degradar la muestra.

Otro componente fundamental en la PCR, es la Taq polimerasa. Junto con los primers, da inicio a la amplificación de las hebras de ADN. Según (Pombo, 2002), la Taq polimerasa, permite la extensión de cadenas a partir de los cebadores, de modo que se copian de forma complementaria, cada una de las hebras molde.

Se notó que se utilizaron dos primers para poder replicar la hebra de ADN, y se notó que estos, se unen en cada una de las hebras del ADN y que son específicos. Según (Ryan et al., 2005) La especificidad, proviene de una secuencia de cerca de 20 nucleótidos en cada par de cebadores, que están diseñados para flanquear el segmento deseado del genoma. Las DNA polimerasas utilizadas son aquellas que operan a temperaturas inusualmente elevadas. Esto permite el uso de la temperatura para controlar los cambios entre la separación de las hebras complementarias de DNA (a fin de que puedan ligarse los cebadores) y la replicación de la secuencia de DNA que se encuentra entre ambos cebadores. Debido a que cada cadena genera un fragmento nuevo, el aumento es exponencial. En un dispositivo denominado termociclador, el DNA especificado puede amplificarse de uno a mil millones de veces en 20 a 30 ciclos

Se utilizó termociclador durante el proceso de la PCR, con el fin de que se realizaran los ciclos de esta, con temperatura constante, de acuerdo a la exigencia de cada una de estas fases. Según (Somma, 2011), el termociclador permite la realización de los ciclos de la PCR, funcionando de acuerdo a tiempo programable en el que mantendrá una temperatura constante en el momento que se necesite cambiar para seguir con el siguiente ciclo, y de esta manera, realizar correctamente la amplificación del ADN.

Durante la electroforesis, fue fundamental la utilización de agarosa, la cual permitió que se produjera un gel, dentro del cual fue puesto el ADN, el ARN y el ADN de PCR. Se notó que después de aplicar voltaje, los nucleótidos,