Micobacterias ambientales, hongos y patógenos oportunistas en no clorada Agua potable en los Países Bajos

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MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo.

Se analizó el agua potable no clorada distribuido en cinco plantas de tratamiento que utilizan agua de superficie (plantas SW1, SW2, SW3, SW4 y SW5) y tres plantas de tratamiento que utilizan las aguas subterráneas (plantas GW1, GW2 y GW3). El agua potable producida en estas plantas difieren en (AOC) concentraciones fácilmente asimilables de carbono orgánico de carbono orgánico total (COT) y, y los recuentos de placas heterotróficas (HPC) en el agua potable distribuida difería también (Tabla1). Estos ocho sistemas de distribución fueron muestreados en el invierno (enero a marzo) y el verano (agosto y septiembre) de muestras de agua de 2010. Beber (2 litros cada uno) se tomaron del grifo de la cocina de agua fría de diferentes casas (planta SW1, 13 casas; SW2, 13 casas; SW3, 11 casas; SW4, 11 casas; SW5, 13 casas; GW1, 12 casas; GW2, 10 casas; GW3, 10 casas) conectados al sistema de distribución de cada planta de tratamiento y el agua la temperatura se midió inmediatamente después fue tomada cada muestra. Una de las muestras también se tomó del agua tratada en cada planta de tratamiento en el verano, a excepción de SW3 planta. Las muestras en el grifo se tomaron de acuerdo con el decreto de agua potable holandés para que representarían el agua potable de la red de distribución. En resumen, cada grifo se barrió hasta que la temperatura del agua se mantuvo estable durante 30 s, y el agua potable se muestreó posteriormente. Se hicieron excepciones a este procedimiento para las muestras recogidas de los sistemas de distribución de plantas SW2 y SW3 en el verano, que fueron tomadas directamente del grifo sin enjuague previo. Estas muestras representan agua potable de los sistemas de plomería premisa. Las muestras de agua fueron transportados y almacenados a 4 ° C y se procesan dentro de las 24 horas después de la recogida.

Mesa 1

Fuente de agua utilizada para la producción de agua potable, TOC y las concentraciones de AOC en el agua tratada, y el recuento de placas heterotróficas en agar de gérmenes a 22 ° C en el agua potable distribuida

Aislamiento de ADN.

Un volumen de 1.000 ml se filtró a través de un filtro de policarbonato de 25 mm (0,22-micras de tamaño de poro, escriba GTTP; Millipore, los Países Bajos). El filtro y un fragmento de ADN de un control interno se añadieron a tampón de fosfato-MT en un tubo matriz E de lisis del kit FastDNA giro para el suelo (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA) y se almacenaron a -20 ° C. El control interno se utilizó para determinar la eficiencia de recuperación de aislamiento de ADN y análisis de PCR (20). Se aisló el ADN de acuerdo con el protocolo del proveedor. El filtro, fragmento de ADN, y el tampón se procesaron durante 30 s a una velocidad de 5,5 en un instrumento FastPrep. Posteriormente, los tubos de la matriz de lisis E fueron centrifugadas durante 30 s a 14.000 × g. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio, y se añadió reactivo de precipitación de proteínas solución de 250 l (PPS) y posteriormente se mezcló con la mano durante 10 min. Los tubos se centrifugaron durante 5 min a 14.000 × g. Posteriormente, el sobrenadante se transfirió a un tubo de 15 ml limpio, y se añadió 1 ml de suspensión de unión a la matriz.Los tubos se invirtieron posteriormente a mano durante 2 min y se colocan en un bastidor de 3 min.Quinientos microlitros de sobrenadante se retiró cuidadosamente y se descartan. Aproximadamente 600 l de la mezcla se añadió a un filtro giratorio y se centrifugaron durante 1 min a 14.000 × g. Posteriormente, el tubo de captura se vació, y el sobrenadante restante se añadió al filtro de giro y se centrifugó de nuevo durante 1 min a 14.000 × g. A continuación, se añadió solución de lavado de sal 500-l de etanol (SEWS-M) para el filtro de giro y posteriormente se centrifugó durante 1 min a 14.000 × g. Posteriormente, el filtro giratorio fue sustituido en el tubo de captura y se centrifugó durante 2 min a 14.000 × g. Después, los filtros de spin se colocaron en tubos de captura-kit suministrado frescos, y los filtros se secaron al aire durante 5 min. Después del secado, se añadieron 200 l solución de elución de ADN (DES), y la matriz en la membrana se agitó suavemente con una punta de pipeta. Finalmente, los filtros de espín y los tubos de captura se centrifugaron durante 1 min a 14.000 × g. El ADN eluido se mantuvo posteriormente a -80 ° C.

Los análisis cuantitativos de PCR.

El número de copias de genes de los patógenos oportunistas en las muestras de agua potable se determinaron con desarrollado previamente por PCR cuantitativa (qPCR) análisis de muestras de agua potable (18). Estos métodos se dirigen a la qPCR potenciador infectividad de macrófagos (MIP gen) de L. pneumophila, el gen 16S rRNA de Mycobacterium spp., el gen 16S ARNr deM. avium complejo, el gen 18S rRNA de hongos, el gen 28S rRNA de Aspergillus fumigatus, la Rega gen de P. aeruginosa, la chiA gen de S. maltophilia, y el gen 18S rRNA de Acanthamoeba spp. (18). Las mezclas de reacción de PCR análisis contenían 25 l de 2 × IQTM SYBR Supermix verde (Bio-Rad Laboratories BV, Veenendaal, Holanda), 0,2 M de cada cebador y, en su caso, de la sonda, de 0,4 mg ml -1albúmina de suero bovino, y 10 l plantilla de ADN en un volumen total de 50 l. La amplificación, detección y análisis de datos se realizaron en un sistema de detección en tiempo real iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories BV). Las secuencias de cebador-sonda y los programas de amplificación se muestran en las Tablas S1 y S2 en el material complementario. El ciclo de PCR después de lo cual se detecta la señal de fluorescencia del ADN amplificado (ciclo umbral [C T]) se utilizó para cuantificar las concentraciones de copias de genes.Cuantificaciones se basaron en la comparación de la muestra C T valor con las C T valores de una curva de calibración basada en el número de copias conocida del gen respectivo de los diferentes microorganismos.

Otros parámetros microbiológicos.

La concentración de ATP en cada muestra de agua potable se determinó midiendo la cantidad de luz producida en el ensayo de luciferina-luciferasa como se describe por van der Wielen y van der Kooij (21). Los números de células totales y la membrana intacta se determinaron utilizando un citómetro de flujo. En resumen, 1 ml de una muestra de agua se incubó con el verde 10 l SYBR (100 × dilución de un concentrado 10.000 ×) (Invitrogen, Carlsbad, CA) y yoduro de propidio 10 l (50 mg / ml) (BD) y se tiñeron para 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente,