PURIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE

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- Muestra en gel de agarosa

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RESULTADOS

Cuantificación del ADN, a través de una muestra de sangre periférica en el nanodrop:

Figura 1: resultados obtenidos por medio de la muestra de and obtenida en el nanodrop. (Grupo 5)

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tabla1: resultados obtenidos durante la lectura del nanodrop de las diferentes muestras de sangre tratadas durante la práctica de laboratorio.

GRUPO MUETRAL

ABS 260NM

ADNMG/ML

PUREZA 260 (ORG) 230

PUREZA 260 (PROTEÍNA)280

ABS 280NM

M1

1.600

80.0

0.44

1.51

1

M2

0.342

17.1

0.30

1.32

0.259

M3

0.393

19.7

0.22

1.78

0.66

M4

1.689

84.4

0.96

1.88

0.900

M5

0.465

23.3

0.19

1.30

0.350

M6

0.746

37.3

1.53

1.90

0.394

Figura 2: Electroforesis de los amplificados de la muestra de sangre tratados.

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ANALISIS DE RESULTADOS

La sangre se compone de varios tipos celulares. Los más importantes son los glóbulos rojos y los glóbulos blancos. Los primeros carecen de núcleo pues lo pierden durante su maduración, por lo tanto no poseen ADN. Los glóbulos blancos, en cambio, poseen núcleo y por tanto ADN. Entonces para obtener ADN a partir de muestras de sangre sólo son necesarios los glóbulos blancos. Si bien, en un principio se purificaban primero los glóbulos blancos para luego extraer ADN a partir de ellos, el posterior avance de la técnica permite hoy en día extraer ADN a partir de sangre entera con la misma pureza, sumando rapidez y sencillez 4.

En la práctica realizada se obtuvo DNA de la sangre periférica total de humano; por el método de altas concentraciones de sales, en donde se utilizó buffer de extracción(tris 10mM,EDTA 1mM, SDS 1%), que cumple la función de lisis o ruptura de las células, es el primer paso para la extracción del ADN. El EDTA se une a cationes divalentes tales como el calcio y el magnesio. Dado que estos iones ayudan a mantener la integridad de la membrana celular, la eliminación de estos con EDTA desestabiliza la membrana. La solución Tris es el principal componente buffer; su función principal es la de mantener el pH del buffer en un punto estable, por lo general 8,0. Además, la solución Tris interactúa con el LPS (lipopolisacárido) de la membrana, lo cual sirve para desestabilizar la membrana aún más5. Al pellet obtenido con buffer se le adiciono la proteinasa K, que es una proteasa que degrada las proteínas de membrana y facilita su lisis, liberando el ADN, esta una proteasa endolytic que rompe los enlaces peptídicos en el lado carboxílico de los aminoácidos alifáticos, aromáticos o hidrofóbicos. La proteinasa K se clasifica como una proteasa de serina, el más pequeño péptido que se hidroliza por esta enzima es un tetrapéptido. Este proceso de lisis de membrana fue complementado con el baño de María ajustado con antelación a 55°C, el cual activa de forma eficiente a la proteinasa K6. Las proteínas fueron eliminadas del extracto mediante precipitación salina (salting-out) con acetato de potasio y posterior centrifugación a 12000 rpm por 5 min, para luego recuperarse el sobrenadante. Para mejorar la pureza, este paso fue realizado 2 veces. Luego, el DNA fue precipitado por adición de isopropanol para la remoción del resto de contaminantes presentes aun en dicha muestra. Seguidamente se le agrego etanol que cumple la función de rehidratar el pellet para luego secar el ADN presente en la muestra y finalmente resuspenderlo con el agua destilada estéril.

Luego se valoró la calidad de ADN y cantidad de ADN humano obtenido durante el proceso de extracción y purificación del ADN. La cuantificación del ADN de muestras de referencia (sangre) se realiza mediante el equipo Nanodrop y se caracteriza porque la muestra se carga directamente en la superficie óptica de medida. El sistema usa una tensión superficial inherente para mantener la muestra en el lugar durante la medida3. Los resultados aparecen en registrados en la ventana de software y que permitiendo conocer la concentración de ADN humano que se obtuvo posterior al proceso de extracción.

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de un medio gelatinoso. Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los