Submódulo I Emplea técnicas clásicas de análisis cuantitativos con base a normas

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Ejemplos

-Las bacterias Gram-positivas

Las bacterias Gram-positivas tienen generalmente una sola membrana rodeada por un peptidoglicano de espesor. Esta regla es seguida de dos filos-Firmicutes y Actinobacteria. Por el contrario, los miembros de la Chloroflexi son monoderms pero poseen un peptidoglicano delgada o ausente y pueden manchar negativo, positivo o indeterminado. Los miembros del grupo Deinococcus-Thermus, tiñen positivamente, pero son diderms con peptidoglicano espesor.

Históricamente, las formas Gram-positivas componen los filo Firmicutes, un nombre que ahora se utiliza para el grupo más numeroso. Incluye muchos géneros bien conocidos tales como Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus y Clostridium. También se ha ampliado para incluir las Mollicutes, bacterias como Mycoplasma que las paredes celulares de la falta y lo que no se pueden teñir por gramo, pero se derivan de tales formas.

Normalmente, si la tinción de Gram se realiza en bacteria ácido-alcohol resistentes se muestran como si son Gram-positivas, sobre todo a causa de su gruesa pared celular.

-Las bacterias Gram-negativas

Las bacterias Gram-negativas poseen generalmente una fina capa de peptidoglicano entre dos membranas. La mayoría de los phyla bacteriana son Gram-negativas, incluyendo las cianobacterias, espiroquetas y bacterias verdes del azufre, y la mayoría de Proteobacteria.

-Las bacterias Gram-indeterminados

Las bacterias Gram-indeterminados no responden a la tinción de Gram y, por lo tanto, no pueden determinarse ya sea como Gram-positivos o Gram-negativos. Algunos ejemplos son bacilos Gram-variables y ácido.

[pic 6]

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR): es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microrganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.

Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistente o BAAR. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.

La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

En una tinción directa el colorante interacciona directamente con el sustrato. En una tinción indirecta se hace interaccionar en primer lugar a una sustancia química denominada "mordiente" con el sustrato la cual permite la posterior interacción del colorante. Usualmente los mordientes son sales, hidróxidos o alumbres de metales bivalentes o trivalentes.[pic 7]

Método de Uso

1) Filtre la fucsina fenicada antes de usarla.

2) Cubra la superficie del extendido con fucsina.

3) Pase la llama del mechero (o torunda empapada en alcohol) por debajo de la lámina, hasta que se produzca la emisión de vapores blanquecinos. Deje de calentar y repita el procedimiento dos veces más. La emisión de los vapores blanquecinos debe lograrse tres veces en 5 minutos, que es el tiempo adecuado de contacto entre el extendido y el colorante. La fucsina no debe hervir sobre la lámina, si disminuye por evaporación o derrame, hay que reponerla.

4) Elimine la fucsina con agua del tubo a baja presión, de manera que la película no se desprenda.

5) Gire la lámina para lavar su cara inferior y así eliminar la fucsina ahí depositada.

6) Cubra la superficie del extendido con alcohol-ácido al 3% efectuando un movimiento de vaivén y espere 2 minutos de modo que el alcohol-ácido lo decolore y arrastre suavemente la fucsina. Esta operación puede repetirse hasta que sobre el extendido se observe un color rosado.

7) Lave la lámina con agua según se describe en el punto d.

8) Cubra el extendido durante 1 minuto con solución de azul de metileno.

9) Lave ambas caras de la lámina con agua.

10) Seque las láminas a temperatura ambiente, en posición vertical, con el extendido hacia el frente.

11) Revise la identificación de los frotis y rotúlelos de nuevo si se borraron durante la tinción.

[pic 8]

Clasificación de las Tinciones

Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).[pic 9]

El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.

La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocit.

La tinción con tinta china es también llamada tinción negativa: se usa un colorante ácido, nigrosina o tinta china, que no entra en la célula de modo que estas no se observan teñidas, lo que se ve de color es el fondo.[pic 10]

Tinción Diferencial

Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. Se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una población. La diferenciación puede ser provocada por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en una misma