Muestras procariotas y eucariotas

PRÁCTICA Nº 6

PREPARACIÓN  Y OBSERVACION DE MUESTRAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

OBJETIVOS:

1. Aprender a preparar y observar muestras para microscopía óptica.
2. Identificar microorganismos mediante el uso de tinciones.
3. Identificar y describir las características microscópicas de las células procariotas y eucariotas.

MARCO TEÓRICO

Cómo las células son demasiado pequeñas para ser observadas a simple vista es necesario utilizar el microscopio óptico. Para aumentar el contraste de los microorganismos y lograr una mejor observación de los mismos, se emplean diferentes técnicas de tinción, las cuales se basan en la capacidad de los microorganismos para retener (o no) ciertos colorantes lo que depende de la carga de la célula y del colorante.

Para teñir las muestras con colorantes es necesario fijar las células en los portaobjetos, para lo cual se realiza una extensión o frotis de la muestra, seguidamente la muestra es flameada en un mechero varias veces con el lado de la muestra hacia arriba, esto es necesario para adherir la muestra al portaobjetos. A continuación se aplicar el colorante, lavar con agua y secar al lado opuesto con papel filtro. La muestra queda lista para su observación en microscopio óptico.

Para las tinciones se utiliza sales compuestas de un ion positivo y otro negativo.

A pH 7 las bacterias tienen carga negativa y por lo tanto el ion positivo coloreado de un colorante básico es atraído por la célula bacteriana. Ejemplos de los colorantes básicos son: cristal violeta, el azul de metileno y la safranina.

Los colorantes ácidos no son atraídos por la mayoría de las bacterias porque los iones negativos del colorante son repelidos por la superficie bacteriana que está cargada negativamente,  de modo que el colorante es repelido por la bacteria y colorea en cambio el fondo de la preparación. Esta preparación de bacterias incoloras sobre un fondo coloreado se llama tinción negativa y  es útil para la observación de la morfología externa de la célula, podemos visualizar su tamaño y las cápsulas.

Ejemplos de colorantes ácidos son la Qosina y la nigrosina.

Para aplicar los colorantes ácidos y básicos los microbiólogos utilizan 3 tipos de técnicas de tinción: simple, diferencial y especial.

Un colorante simple es una solución acuosa o alcohólica de un solo colorante básico. Aunque distintos colorantes se unen específicamente a partes diferentes de la célula, el objetivo primario de una tinción simple es destacar al microorganismo entero, para que  la morfología y las agrupaciones celulares resulten visibles. El colorante se aplica a la extensión fijada durante un tiempo determinado, después se lava la preparación y se seca. Posteriormente es examinada. Ejemplos de colorantes simples utilizadas en el laboratorio son: azul de metileno, violeta de genciana y la safranina.

En contraste con las tinciones simples, las tinciones diferenciales dan reacciones distintas con diferentes tipos de bacterias y por lo tanto permiten diferenciar de manera más explícita los microorganismos.  La tinción diferencial más utilizada es la tinción de gram.

Tinción diferencial de Gram:

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram positivas y gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 – 2 min. Lavar y secar.

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas se tiñen de forma distinta, debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar tamaño y forma al microorganismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano  y ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.

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Descripción de la tinción de GRAM:

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las gram positivas como las gram negativas, están teñidas de azul.

El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células gram positivas como las gram negativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células gram positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células gram positivas son todavía azules, pero las gram negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas permanecen azules.