PRACTICA DE DETECCIÓN DE VIRUS POR METODO ELISA

Universidad de San Carlos de Guatemala.[pic 1][pic 2]

Facultad de agronomía.

Introducción a la fitopatología

Ing. Agr. Amílcar Sánchez

Escuela junio 2019

PRACTICA DE DETECCIÓN DE VIRUS POR METODO ELISA

Dennis Humberto Nájera Barillas

Carné: 201603242

Guatemala 2019.

Introducción

Para los diagnósticos fitopatológicos se pueden emplear técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por método de ELISA por inmunostrip o por ELISA Sandwich. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican una enzima como marcador para mediar la formación de complejos antígeno-anticuerpo. El marcador enzimático que se emplea en estos análisis se conjuga con un ligado, que puede ser un antígeno, un anticuerpo específico para el antígeno de interés.

En el laboratorio utilizamos la prueba de Elisa Sandwich es una técnica confiable y rápida para la detección de fitopatógenos. Esta técnica consiste en la absorción de anticuerpos específicos a una placa de poliestireno en la que posteriormente se añade el antígeno que reacciona con los anticuerpos adheridos a la placa, complementado con la adición de un conjugado enzimático para formar el complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo.

Objetivos

• Conocer la importancia del conocimiento teórico para la realización de la prueba serológica ELISA.
• Realizar la prueba serológica ELISA en el laboratorio con el fin de adquirir experiencia en la identificación de agentes Fitopatógenos.
• Detectar el fitopatogeno Candidatus Liberibacter en la prueba realizada en laboratorio.

Metodología

• Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba.
• Preparar el volumen necesario de Buffer de Lavado (1x).
• Colocar en el soporte de tiras, el número de pocillos requeridos para la cantidad de determinaciones a realizar, incluyendo 1 pocillo para el Control Positivo (CP) y 1pocillo para el Control Negativo (CN).
• Elaborar un esquema de la distribución de las muestras y controles.
• reparar las muestras de tejido vegetal, agregando 100 mg a un tubo eppendor de 1.5 ml. Agregar 250 microlitros de solución extractora, macerar con pistilo hasta homogenizar las muestras.
• Dispensar 100 microlitros para cada pocillo, la muestra (M) y los controles según el esquema elaborado. M CP CN Control Positivo - 100 ul - Control Negativo - - 100 ul Muestra 100 ul –
• Para evitar la evaporación, cubrir la placa con nylon e incubar a temperatura ambiente durante 20 ± 2 minutos. En forma paralela, preparar el Conjugado.
• Después de la incubación eliminar por completo el líquido de cada pocillo. Lavar 5 veces según instrucción de lavado.
• Agregar solución con la enzima conjugada, 100 ul. Para evitar la evaporación cubrir los pocillos.
• Incubar 15 ± 1 minutos a temperatura ambiente. En forma paralela, preparar el Revelador.
• Lavar 5 veces según instrucción de lavado.
• Dispensar el Revelador. Revelador 100 microlitros.
• Incubar seis horas a temperatura ambiente (18- 25 C), protegido de la luz, o incubar durante toda la noche a 12 grados centígrados
• Agregar la solución de finalización, (Stopper) 100 ul, seguidamente hacer la lectura visualmente, las muestras con resultado positivo tendrán una coloración amarilla y las muestras con resultado negativo serán incoloras.

Marco teórico

Marco Referencial

La prueba se realizó en el laboratorio de fitopatología en el edificio de UVIGER.