Evaluación de antagonismo bacteriano con cepas ambientales
Enviado por Stella • 6 de Junio de 2018 • 1.021 Palabras (5 Páginas) • 391 Visitas
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1.-Conseguir hojas tres plantas diferentes (Higo, Níspero y Encino).
2.-Cortarlos en trozos pequeños e introducirlos en tubos falcón de con 100 ml de agua estéril.
3.-Despues hacer disoluciones de 100 ml.
4.-Preparacion de medio LB.
5.-Vertir dicho medio en 13 placas de plástico marcándolas.
Higo= H1, H2, H3 Níspero= N1, N2, N3 Encino: E1, E2, E3 70(cepa control)
6.-Incubar por 24 hrs y una temperatura de 24 hrs.
7.-Con una asa de platino extraer el microorganismo y mesclar en tubos ependor con 1000ul de agua estéril.
8.- Ahora en placas de cristal verter medio LB.
9.-Luego agregar en dichas placas agregar 50ul por triplicado de cada uno de las suspensiones de los microorganismos extraídos en las cepas, e incubar por otras 24hrs y a la misma temperatura.
10.-Por consiguiente limpiar las cepas de vidrio con un hisopo y alcohol.
11.-Agregarles cloroformo y ponerlos durante una hora en la campana.
12.-Posteriormente dejar otros minutos al aire.
13.-Hacer una suspensión de la cepa sensible ajustada a una densidad óptica de 0.005 (E2).
14.-Luego con una asa de cristal agregar a las placas 200 ul de dicha suspensión y platear.
15.-Esperar a que sequen e incubar durante 24 a 48hrs.
16.-Observar los halos de inhicion.
17.- Para comprobar se hace una PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
18.-Luego en una campo eléctrico se agrega gel de agarosa y final la suspensión de la PCR.
19.- Se deja correr durante una hora.
20.- Se lleva dicho gel en la cámara y se observan las bandas presentes.
21.-Se realizan pruebas bioquímicas como tinción de Gram, prueba de catalasas y oxidasas con las cepas obtenidas al principio y se registra los resultados.
22.-Comparacion de los microorganismos utilizando la secuenciación del Gen 16S ribosomal.
Resultados
Empleando ensayos de antagonismo en doble capa detectamos tres cepas antagónicas. Utilizando secuenciación del gen 16S ribosomal ubicamos a nivel taxonómico a la cepa H2 como Variovorax sp. (Aislada de la planta de higuera) y a las cepas E2 y E3 como Bacillus sp. (Aisladas de encino). La cepa H2 inhibe microorganismos Gram positivos, mientras que las cepas E2 y E3 exhiben inhibición de amplio espectro. En los ensayos de antagonismo asociado a movimiento swarming se aprecia una zona clara de inhibición entre las cepas E2 y E3 probablemente relacionada a la producción de moléculas antimicrobianas.
[pic 1]
[pic 2]
[pic 3]
Electroforesis de las distintas cepas.
Tinción de Gram de la Cepa H2
Formación de halo de inhibición debido a la presencia de metabolitos antimicrobianos.
[pic 4]
[pic 5]
[pic 6]
Antagonismo utilizando una cepa sensible (E2) y una cepa control (70).
Ensayo de movilidad swarming entre distintas cepas
Gráfica de mecanismo antagónico en doble capa en las diferentes cepas.
Conclusiones
Se concluye que las bacterias epifitas aquí reportadas tienen un alto potencial para producir metabolitos inhibitorios. Además se considera que estos microorganismos pueden ser empleados para pruebas como agentes de Biocontrol debido a que están relacionados a bacterias no patógenas de plantas.
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