Una novela FMR1 método PCR para la detección rutinaria de baja abundancia Ampliado alelos y Full Las mutaciones en el Síndrome X Frágil

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Materiales y METODOS

Las muestras de ADN clínicos y de líneas celulares

Las muestras de sangre fueron obtenidas de individuos evaluados en la Clínica Instituto MIND después de haber dado su consentimiento informado y de acuerdo con un protocolo de la Junta de Revisión Institucional aprobado. gDNA fue aislado a partir de leucocitos de sangre periférica (5 ml de sangre completa) con métodos estándar (Kit de Sangre Puregene Gentra; Qiagen). Sólo el número de código era conocido por el técnico que maneja las muestras. Un total de 146 muestras codificadas fueron enviados a Asuragen para el análisis de PCR. Todas las muestras de ADN de líneas celulares se obtuvieron de Repositorios Coriell Cell (Instituto Coriell para la Investigación Médica). Muestras de ADN clínicos y la línea celular se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) y se diluyeron a 20 ng / l en 10 mmol / L Tris, 0,5 mmol / L de EDTA, pH 8,8, antes de la PCR.

Todos los lotes de muestras de PCR incluyen al menos una línea celular "control del proceso." Agrupada El control del proceso se genera a partir de 4 muestras-NA20239 línea celular (10 ng / l), NA07541 (5 ng / l), NA20230 (12 ng / l) , y NA06891 (10 ng / l), es decir se mezclaron en agua desionizada. El uso de este control produce picos de productos de PCR 6 correspondiente a 20, 29, 31, 54, 119, y 199 repeticiones CGG que podrían ser detectados en un único capilar. Amplicones alelo para 29, 54, y 119 repeticiones CGG fueron verificadas directamente por secuenciación de ADN, y amplicones para los de 20 y 31-CGG repeticiones fueron emparejados con el tamaño de pares de bases de los alelos verificados secuenciados. En cada uno de estos casos, la desviación desde el resultado de la secuenciación fue de menos de una sola repetición CGG. La longitud de repetición del alelo 199-CGG fue inferida por esta línea celular a partir de la calibración del sistema a los primeros 5 alelos. Por último, la reproducibilidad de la detección para cada uno de los 6 alelos de control de proceso produce una SD de menos de una sola repetición CGG a través de 12 carreras CE independientes.

Para evaluar la sensibilidad analítica de PCR y transferencia de Southern, hemos preparado una muestra de control heterocigotos hembra mock mezclando el ADN aislado de muestras de 2 líneas celulares, NA06895 (23 repeticiones CGG) y NA09237 (940 CGG repite). Estos aditivos conservan la misma entrada de masa en cada caso, 7 g de transferencia de Southern y 40 ng para la PCR, mientras que el porcentaje en masa del alelo 940-CGG se varió de 1% a 100%.

específicos de gen FMR1 PCR

Las muestras se prepararon para la PCR con una mezcla maestra de Asuragen contiene 11,45 l GC-Rich AMP Buffer, 1,5 l de 6-carboxifluoresceína (FAM) marcado con FMR1cebadores, y 0,05 l GC-Rich Mix polimerasa. Los cebadores fueron FMR1 Forward (TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A) y FMR1 inversa (FAM-AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CC). La mezcla maestra era vórtice mixta antes de dispensar en una placa de microtitulación (96 o 384 pozos; Phenix Research Products). Las alícuotas de la muestra de ADN, típicamente de 2 l a 20 ng / l, se transfirieron a la placa. Placas selladas (ABGene de aluminio; Phenix Research Products) eran-vórtice mezclado, se centrifugó, y se transfirió a un ciclador térmico (ABI 9700; Applied Biosystems). Las muestras se amplificaron con un paso de calor de desnaturalización inicial de 98 ° C durante 5 min; 25 ciclos de 97 ° C durante 35 s, 62 ° C durante 35 s, y 72 ° C durante 4 minutos; y una final de extensión a 72 ° C durante 10 min. Después de la PCR, las muestras se almacenaron protegidos de la luz a -15 ° C a -30 ° C antes de su análisis por la edad o de la CE. Un esquema para la tecnología y el trabajo de flujo se muestra en la Fig. 1 ⇓ .

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Figura 1.

El flujo de trabajo para la amplificación y detección de amplicones FMR1 con nuevos frágiles reactivos X PCR.

GDNA de entrada es amplificada por 2 cebadores específicos del gen (Fwd y Rev) en un solo tubo. Después de la amplificación, CE resuelve los productos, uno para cada alelo presentes en la reacción, incluyendo alelos de mosaico. El electroferograma resultante se interpreta con relación a una escalera de dimensionamiento para determinar el número de repeticiones CGG para cada amplicón. Alternativamente, los amplicones se pueden resolver por la edad. UTR, región no traducida.

electroforesis en gel de agarosa

Se combinaron 6 l de la reacción de PCR con 3 l de 3 × AGE colorante de carga (/ L de glicerol 150 g, 2,5 g / L de azul de bromofenol; ambos de Sigma-Aldrich); todo el volumen 9-l se cargó en un gel de agarosa-17.5 g / L. Los geles se tiñeron con SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10 000 ×; Invitrogen) y la imagen de la luz UV con un sistema de detección de imágenes FluorChem 8800 (Alpha Innotech).

electroforesis capilar

CE ofrece una resolución de una sola repetición, que es mucho mayor que la de electroforesis en gel de losa, y por lo tanto es la plataforma de elección para proporcionar una cuantificación precisa de repeticiones, especialmente para muestras con números límite de CGG repite (por ejemplo, 45 o 55 repeticiones). A 3130 xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) que se ejecuta polímero POP-7 (Applied Biosystems) con 36 cm capilares se utilizó para todos los experimentos. Las muestras se prepararon para el análisis de CE mediante la mezcla de 2 l de producto de PCR no purificado con 11 l de Hi-Di formamida (Applied Biosystems) y 2 l de la ROX 1000 Size Ladder (Asuragen). Por tanto, las muestras preparadas fueron desnaturalizados a 95 ° C durante 2 min y después se enfriaron a 4 ° C durante al menos 2 min. Excepto donde se indique, aplican voltajes para todas las inyecciones eran 2,5 kV durante 20 s con un 40 min carrera en 15 kV.

análisis de los datos

Los productos de PCR fueron analizados por EDAD tamaño en relación con la escala de tamaño molecular de hasta aproximadamente 1.500 CGG repite. Los productos de PCR detectados por CE se analizaron con el software de GeneMapper (versión 4.0;