ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº 1: NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO Y ESTERILIZACIÓN

...

Se entiende por esterilización la destrucción completa o la eliminación total de los microorganismos patógenos y saprofitos que se encuentran en el interior o en la superficie de los objetos y sustancias.

Clasificación:

Los procedimientos de esterilización pueden clasificarse en 2 grandes grupos:

- Físicos: Conducen especialmente a la asepsia (ausencia total de gérmenes patógenos) y se basan en la aplicación de agentes físicos corrientes o naturales como lo son el calor, la luz y la filtración. Estos métodos son los que ofrecen mayor seguridad en las técnicas de rutina del laboratorio de microbiología.

- Esterilización por calor:

a.1- Esterilización por calor seco: Genera la carbonización de los microorganismos.

- A la llama: Es un procedimiento muy eficaz cuando el material a esterilizar es indestructible o se va a inutilizar. Se aplica para esterilizar asas, pinzas, bocas de tubos o matraces, etc., empleando la llama del mechero de Bunsen (en estos últimos casos se habla de “flameado”). Cuando además de matar bacterias se destruye mediante el fuego el material que las contiene, se habla de incineración. Este procedimiento se emplea para destruir animales muertos de enfermedades infecciosas, ropas y objetos altamente contaminados. Se recomienda incinerar los cadáveres de los animales de laboratorios en hornos crematorios.

- Por aire caliente: El aire caliente confinado a temperatura de 160ºC–180ºC mantenido durante 1–2 hrs., destruye con seguridad todas las bacterias y sus esporas. Para su aplicación se recurre al horno de aire caliente siendo el más usado el Horno Pasteur.

El horno Pasteur se emplea para esterilizar material de vidrio (pipetas, tubos de ensayo, matraces, placas petri, etc.) y nunca para esterilizar medios de cultivo.

Manejo del horno Pasteur: El material a esterilizar se deposita en el horno sin que toque las paredes ni el fondo (se entiende la resistencia eléctrica), el calor producido se transmite al aire que circula en todo su interior. La temperatura asciende lentamente entre 160ºC–180ºC, la que se mantiene por 1–2 hrs. de acuerdo a la temperatura usada, luego se apaga la fuente calórica y se deja enfriar. La puerta del horno se abre sólo cuando la temperatura se iguala a la del ambiente para evitar la ruptura del material de vidrio. Como control se observa el papel que envuelve el material y el algodón que tapona los tubos, los cuales adquieren una coloración pardo–clara una vez terminada la esterilización. Se debe evitar la carbonización del papel y del algodón, dado que se produce un alquitrán rico en sustancias antisépticas que impiden el desarrollo posterior de las bacterias a cultivar.

a.2- Esterilización por calor húmedo: Genera coagulación de las proteínas bacterianas.

- Por agua en ebullición: El agua en ebullición es suficiente para matar las formas vegetativas de las bacterias, pero no sus esporas. Se utiliza para esterilizar jeringas, agujas, pinzas y portaobjetos que se depositan en un recipiente que contiene agua.

- Por vapor fluente: Vapor activo que emana de un receptáculo sometido a una fuente calórica. Se utiliza para la esterilización de los instrumentos de cirugía, equipos de lechería y en las industrias conserveras para muy diversos fines. Su temperatura alcanza aproximadamente los 100ºC, si se mantiene sin presión y a nivel del mar. Bastan 15 minutos de vapor fluente para destruir las formas vegetativas de las bacterias, pero no sus esporas, para lo cual es necesario repetir en forma intermitente. Este último tipo de esterilización intermitente se denomina tyndalización y se caracteriza por el calentamiento discontinuado a 100ºC durante 30 minutos, operación que se repite 3 veces a intervalo de 24 horas. En bacteriología se usa principalmente para esterilizar medios de cultivo que llevan sustancias que se alteran cuando se someten a temperaturas mayores durante largo tiempo, como por ejemplo los medios con azúcares.

- Por vapor a presión: Para lograr una destrucción completa de las esporas bacterianas, es necesario alcanzar temperaturas superiores a la de ebullición del agua, lo cual se consigue mediante el uso de un autoclave, que consiste en una cámara en la que el vapor se introduce y se mantiene a presión. El vapor a presión, en ausencia de aire, tiene una temperatura constante, por lo tanto si se conoce la presión del vapor, se puede determinar fácilmente la temperatura.

Temperatura del vapor.

Presión del vapor.

Vapor a 100ºC

1 atmósfera (15 lbs.)

Vapor a 105ºC

1,2 atmósfera

Vapor a 110ºC

1,4 atmósfera

Vapor a 115ºC

1,7 atmósfera

Vapor a 120ºC

2 atmósfera

En el laboratorio éste procedimiento tiene aplicación en la esterilización de medios de cultivo y material contaminado (ej.: agar nutritivo, caldo nutritivo, placas, pipetas contaminadas, etc.). La esterilización se realiza generalmente a 120ºC durante 20 minutos, dependiendo de la cantidad o volumen de material o medio de cultivo a esterilizar. Si este método se realiza en condiciones adecuadas, se asegura una absoluta esterilización.

Recomendaciones generales del manejo de un autoclave:

- Debe haber suficiente agua en el fondo del cilindro.

- Cargar la cámara esterilizadora con el material a esterilizar.

- Cerrar herméticamente el autoclave.

- Encender el sistema calórico y abrir la llave de escape para eliminar el aire, ya que si éste permanece en su interior, altera la relación temperatura–presión. Se tiene la seguridad que todo el aire ha escapado cuando sale un chorro continuo. Inmediatamente se cierra la llave de escape y comienza a acumularse el vapor, cuya presencia indica la aguja del manómetro.

- Una vez alcanzada la presión correspondiente a la temperatura de trabajo, se disminuye el calor, regulándolo para mantener la temperatura constante durante el tiempo necesario.

- Una vez concluido el