Bioquimica (ovolumina)

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Donde:

I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida)

I0 es la intensidad de la luz incidente.

TRANSMITANCIA

Se define como la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo.

Existen varios tipos de transmitancia, dependiendo de qué tipo de energía consideremos.

La transmitancia óptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fracción de ese haz de luz atraversará el cuerpo, según su transmitancia. El valor de la transmitancia óptica de un objeto se puede determinar según la siguiente expresión:

[pic 8]

I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I0 es la cantidad total de luz incidente.

Muchas veces encontraremos la transmitancia expresada en porcentaje, según la fórmula:

[pic 9]

- CONCENTRACIÓN DE EXTINCIÓN MOLAR

Si l es un cm y c es I mol/L: La absorbancia sería igual al coeficiente molar de extinción (K). El cual es característico para un compuesto dado. El coeficiente molar de extinción producida por I mol /L en un recorrido de la luz de 1cm.

- CONCENTRACIÓN DE EXTINCIÓN ESPECÍFICA

No se puede conocer fácilmente el peso molecular de algunos compuestos tales como proteínas y ácidos nucleicos presentes en una mezcla y en éste caso se usa éste coeficiente.

Este se define como la extinción de 10gr /L del compuesto en un recorrido de 1cm. [pic 10]

- LIMITACIONES DE LA LEY DE LAMBERT- BEER

Algunas veces no son lineales los gráficos de extinción en función de la concentración y esto se debe probablemente a que no se cumple algunas de las siguientes condiciones.

La luz debe ser de preferencia monocromática o La longitud de onda debe estar entre límites muy estrechos.

La longitud de onda de luz empleada debe coincidir con el máximo de absorción de la solución.

No debe hacer ionización, asociación, disociación, o solvatación del soluto con respecto a la concentración de él mismo.

La ley sólo se cumple hasta cierto límite máximo de concentración, característico para cada sustancia.

[pic 11]

- FACTORES QUE AFECTAN A LA LEY DE LAMBERT-BERR

1) Causas instrumentales: Puede ser:

- La fuente de radiación debido a que la fuente no suministra una radiación completamente monocromática, es decir que hay fallas en la emisión.

- Variación de la intensidad de la fuente debido a fallas de voltaje esto hace que también disminuya el amperaje.

- El monocromador (prisma o red de difracción) es decir que el sistema óptico no suministra longitudes de onda separadas.

- El ancho de la rendija: puede ser muy ancho y esto nos dará un espectro de poca resolución. Es decir que la rendija favorece la pureza de la longitud de onda: La pureza de la longitud de onda está limitada por la sensibilidad del detector.

2) Causas químicas:

a. El solvente

- El solvente debe ser el mismo en la muestra y estándar

- No debe absorber radiación en la región que se mide.

- No debe evaporarse (aumenta la concentración)

- Debe ser lo más puro posible (grado espectroscópico)

b. La muestra:

- Debe ser homogénea no debe tener partículas en suspensión.

c. El PH

- Debe ser el mismo y permanecer constante tanto en patrones como en la muestra.

d. Formación de complejos

- Puede desviar el máximo de absorción de la muestra por analizar.

- CUANTIFICACION DE PROTEINAS DE SOLUCION

En general, no hay método completamente satisfactorio para medir la concentración de proteínas en una muestra. La elección del método depende de la naturaleza de la proteína, de los componentes, de la rapidez y sensibilidad deseada.

En esta práctica veremos de un método que se usa corrientemente para medir concentraciones de proteínas BIURET.

- METODO DE BIURET

El reactivo del biuret lleva sulfato de cobre (II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptidicos de la albumina formando un complejo de color violeta (biuret) cuya intensidad del color depende de la concentración de proteínas, lo que facilita y da lecturas más precisas de concentración.

La determinación de la concentración de proteínas por el método biuret se basa en la formación de complejos coloreados de las proteínas con sales de Cu++ en medio alcalino.

El reactivo con compuestos que tiene dos grupos –CO–NH- unidos a un mismo átomo de N o C, por lo tanto, no es una reacción específica de proteínas. La intensidad de color azul violáceo, es proporcional a la concentración de proteínas del medio. El color se debe a la formación de un complejo de coordinación del catión con cuatro nitrógenos.

Los componentes que tienen dos o más uniones peptídicas (por ejemplo: péptidos y proteínas) dan color purpura característica cuando se trata con solución de sulfato de cobre diluido.

El color se debe aparentemente al complejo de coordinación del cobre con cuatro átomos de nitrógeno (N), ubicados a una determinada distancia.

Este método