ENSAYO DE DECOLORACIÓN CON EL RADICAL CATIÓNICO ABTS∙

...

[pic 4]

Donde ms es la pendiente de cada concentración y mc es la pendiente del control. El IC50 fue calculado a partir de una regresión exponencial, donde la abcisa representa la concentración y la ordenada el porcentaje de inhibición.

3.3.1.5 ENSAYO DE LA INHIBICIÓN DE XANTINA OXIDASA

La actividad para inhibir el sistema xantina oxidasa/xanthina fue medida de acuerdo al método de Noro et al [19]. La mezcla de reacción fue 0.1 mL of isoespintanol a diferentes concentraciones, 0.3 mL de buffer fosfato de pH = 7.5 (50 mM) y 0.1 mL de xantina oxidasa (0.5 unit/mL) en buffer fosfato de pH = 7.5 (50 mM). La mezcla se incuba a 25°C por 15 min, y la reacción se inicia con la adición de 0.3 ml HCl 1N., se mide la absorbancia a 290 nm. Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que produce 1μM de acido úrico por minuto a 25 °C. La actividad de la enzima se define como:

[pic 5]

Donde, A es la actividad de la enzima sin muestra y B es la actividad de la enzima con muestra

3.3.1.6 ENSAYO DE DECOLORACIÓN DE β-CAROTENO

Esta técnica fue desarrollada por y modificada Rosas et al 1999 [20]; está basada en la decoloración de β-caroteno en la presencia de metil-linoleato o ácido linoleico como sustratos oxidables en una emulsión acuosa que usa tween 20 como agente emulsificante. La técnica es sencilla, rápida y se usa una mínima cantidad de reactivos y equipos de fácil acceso. La técnica se fundamenta en la decoloración del beta caroteno debida a su reacción con los radicales libres formados del proceso de oxidación del ácido linoleico o metil linoleato, usados como sustratos oxidables. En esta reacción los radicales destruyen la conjugación del beta caroteno, disminuyendo su capacidad de absorción a 455 nm [21].

Emulsión de β-caroteno: En el ensayo se mezclan, 1 mL de una solución de β-caroteno (0.2mg/mL de cloroformo), los cuales se adicionan a un balón volumétrico de 100 mL que contiene 15 μL de metil linoleato y 0.2 mL de Tween 20; la mezcla se lleva a sequedad. Al residuo resultante se le adicionan 100 mL de agua suprapura previamente saturada con oxigeno.

Referencia Control Rc: Contiene 1.9 mL de la emulsión de β-caroteno y 100 μL

Muestra referencia Rs: Contiene 1.9 mL de la emulsión de β-caroteno y 100 μL

Los tubos de reaccion se incuban 1 hora a 50ºC; y se miden los cambios de absorbancias de las soluciones a 465 nm. Todos los ensayos se efectuaron por triplicado. La actividad antioxidante se expresa como:

[pic 6]

Los valores de IC50 se calculan a partir de regresiones simples (dobles reciprocas); donde la abcisa es la concentración de las muestras (mg/L) y la ordenada es el porcentaje de inhibición (AA %).

3.3.1.7 ENSAYO CINÉTICO DEL DPPH

La actividad atrapadora del radical DPPH· fue medida combinando los métodos de Brand-Williams et al 1995 y Espín et al 2000ª [22, 23]. Se mezclaron, 2 mL de una solución metanólica de DPPH (20mg/L) con 1 mL de soluciones en DMSO de los compuestos y la referencia (BHT). Después de 6 min de reacción, para cada concentración de muestra o referencia se midió la concentración de DPPH· remanente, usando una curva de calibración Abs517nm versus concentración de DPPH· (mol/L). El comportamiento cinético es una regresión exponencial donde la abcisa es la concentración de remanente de DPPH· y la ordenada el tiempo en (s); la pendiente de la curva para cada concentración es la constante observada kobs. Con los diferentes valores de kobs para cada concentración se correlacionan con la concentración del antioxidante para obtener una regresión lineal con la nueva pendiente kRSC, cuyo valor determina el comportamiento cinético para cada compuesto

22. Brand-Williams W, Cuvelier ME y Berset C. 1995. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie 28: 25-30.

23. Choi HS, Song HS, Ukeda H y Sawamura M. 2000. Radical-scavenging activities of citrus essential oils and their components: Detection using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl. Journal of Agriculture and Food Chemistry 48: 4156-4161.

24. Sánchez-Moreno C, Larrauri JA y Saura-Calixto F. 1998. A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols. Journal of the Science of Food and Agriculture. 76: 270-276).

25. Benzie IFF y Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Analitical Biochemistry 239: 70-76.

26. Jiménez, A. S., A.; Torres, J. L.; Julià, L. (2004). "Reducing activity of polyphenols

with stable radicals of the TTM series. electron transfer versus H-abstraction reactions

in flavan-3-ols." Org. Lett. 6: 4583 - 4586.

1. Halliwell B. The antioxidant paradox. Lancet 2000; 355: 1179-1180.

2. Choksi RB, Boylston WH, Rabek JP, Widger WR, Papaconstantinou J. Oxidatively damaged proteins of heart mitochondrial electron transport complexes. Biochim Biophys Acta 2004; 1688 (2): 95-101.

3. Yilmaz S, Ozan S, Benzer F, Canatan H. Oxidative damage and antioxidant enzyme activities in experimental hypothryroidism. Cell biochemistry and function 2003; 21: 325-340.

4. Szeto YT, Collins AR, Benzie LFF. Effects of dietary antioxidants on DNA damage in lysed cells using a modified comet assay procedure. Mutat Res 2002; 500: 31-38.

5. Mark R, McCalland B. Can antioxidants vitamins materially reduce oxidative damage in humans? Free Radic. Biol. Med. 1999; 26 (7/8): 1034-1053.

6. Dinçer Y, Akçay T, Ilkova H, Alademir Z, Özbay G. DNA damage and antioxidant defense in peripheral leukocytes of patients with Type I diabetes mellitus. Mutat Res 2003; 527: 49–55.

7. Sierens J, Hartley JA, Campbell MJ, Leatherm AJC. In vitro isoflavone supplementation reduces hydrogen peroxide induced DNA damage in sperm. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 2002; 22: 227-234.

8. Da silva J, Herrmann SM, Heuser V, Peres W, Possa Marrón N, Gonzalez-Gallego J, Erdtmann B. Evaluation of the genotoxic effect of rutin and quercetin by comet assay and micronucleus test. Food Chem. Toxicol 2002; 40: 941–947.

9.