Ejemplo de uan Organización Subcelular

...

RESULTADOS

Contenido de los pellet obtenidos tras cada centrifugación:

P1: Fracción nuclear

P2: Fracción mitocondrial

[pic 2]

Observación Fracción Nuclear: (P1)

[pic 3]

Muestra: Fresca

Objetivo: 40X

Tinción: Azul de tripan

Observación: Se distinguen esferas de color azul totalmente rotas que corresponden a los núcleos de las células del hígado de pollo.

Fraccionamiento subcelular mediante marcadoresmoleculares:

Nº

Muestra

Succinato 0,1M

Azul de Metileto

Agua

Destilada

HC

FN

FMit.

Observaciones, reacción (+) ó (-)

1

Blanco

1mL

1mL

1mL

(-) no hubo reacción, color azul intenso

2

Homogenizado Crudo (HC)

1mL

1mL

1mL

1mL

(-) no hubo reacción

3

Fracción Nuclear (FN)

1mL

1mL

1mL

1mL

(-) no hubo reacción

4

Fracción

Mitocondrial

(FMit)

1mL

1mL

1mL

1mL

(-) no hubo reacción

[pic 4] [pic 5]

[pic 6]

DISCUSIÓN

En la observación microscópica de las fracciones del fraccionamiento celular, se sacó una gota suspendida de Pellet 1 (P1) y se le agregó una gota de azul de tripan, se observó en el microscopio usando para ello el objetivo 40X. Se logró observar un fondo azul claro con puntos pequeños de color azul intenso. Esto resultados se obtuvieron debido al azul de tripan, que se le conoce como un colorante básico, que se une al ADN localizado dentro de los núcleos, y que los colorantes básicos se unen a ella cuando se encuentra ionizada3. Sin embargo, no se pudieron apreciar del todo bien, ya que al estar congelado la muestra los núcleos se rompieron.

Para poder evaluar el fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares, primero se colocaron en distintos tubos de Eppendorf muestras obtenidas, a través, de una centrifugación diferencial, la cual separa la muestra dependiendo del tamaño de cada componente celular del hígado de pollo, el cual fue tratado con el buffer IBC, para evitar que las células se reventaran. Parte de este HC es guardado, y la otra parte centrifugada 2 veces a distintas velocidades y distintos tiempos para obtener el fraccionamiento celular. Luego de este proceso las muestras de 1ml que fueron guardadas para evaluar, que eran Homogeneizado crudo de hígado de pollo (HC), Pellet 1 (P1), sobrenadante 1 (SN1), pellet2 (P2), sobrenadante 2 (SN2) y por último, un control de agua oxigenada. A cada uno de esos tubos se les agregó la misma cantidad de 400 µl de succinato 0,1M, 100µl de azul de metileno, 400µl de agua oxigenada y 100µl de vaselina, la cual evita que la muestra sea afectada por el oxígeno que se encuentra en el ambiente. Todas las muestras tenían un azul intenso debido al azul de metileno aplicado, luego fueron sometidas a un baño termorregulador de 37ºC durante 10 minutos.

Se pudo observar, que después del proceso anterior las muestras Blanco, HC, P1 y P2 se pudo observar que las muestras mantuvieron su color azul intenso. La separación de los distintos componentes celulares se permiten diferencian por los distintos tipos de organelos, que contienen distintas enzimas o moléculas que lo caracterizan ya que no se encuentran en las distintas separaciones y que con colorantes básicos se pueden identificar. El azul de metileno, es uno de los tipos de colorantes que sirven para definir qué tipo de componentes existen dentro de la muestra, ya que, al estar en un estado oxidado tiene un color azul pero al ser reducido este se transforma a un color incoloro, es decir, se destiñe. Además que al estar reducido, se puede fácilmente volver a oxidar, debido al oxigeno que se encuentra en el aire, por eso se recomienda cubrirlo con algún aceite mineral o vaselina liquida.4 Sin embargo, estos cambios no se observaron debido a que la muestra se encontraba congelada modificando los resultados.

CONCLUSIÓN

Se pudo concluir, que el fraccionamiento celular obtenido, a través, de los distintos pasos como la homogeneización y la centrifugación del hígado de pollo fueron exitosos, ya que, se logró poder seguir todos estos pasos para la obtención del fraccionamiento celular.

De una manera general, podemos constatar que finalizada la actividad práctica, se pudo establecer un análisis a cerca del fraccionamiento subcelular, permitiéndonos distinguir e identificar los componentes de una fracción subcelular y los organelos presentes en cada uno de ellos siendo parte de los componentes celulares, los cuales cumplen importantes funciones para el buen funcionamiento celular, obteniendo que el fraccionamiento subcelular es una técnica que nos permite