LOS AMINOÁCIDOS.

...

- REDUCCIÓN

Usando un agente reductor marcado con tritio permite monitorear el aminoalcohol formado por métodos radioisotópicos. El LiB3H4 introduce 3H en el producto el cual emitirá partículas β- cuya energía liberada (0.0186 MeV) es medida por centelleo líquido. (Recuerde que 1 MeV = 3.85X10-14 cal = 1.6X10-13J).

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- DESCARBOXILACIÓN OXIDATIVA (NINHIDRINA): pH 5 y 100°C

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- o-FTALALDEHIDO (10-12 – 10-15)

[pic 13]

- DANSILACIÓN

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- REACCIÓN DE EDMAN (Isotiocianato de fenilo: ITF)

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- N-ACILACIÓN (para proteger grupo amino)

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C-. SEPARACIÓN DE MEZCLAS

Los AA pueden separarse de mezclas que los contienen recurriendo a técnicas cromatográficas y electroforéticas. Este tema puede ampliarlo revisando “herramientas de la bioquímica” que aparecen en el libro de texto.

- Cromatografía en capa fina (TLC, ccf, ccd) 2-D.

La fase estacionaria puede fijarse en una matriz de “gel de sílice” o de “celulosa MN 300”. La fase móvil es mixta y las condiciones del proceso se detallan a continuación:

MATRIZ

FASE MÓVIL

PROPORCIÓN v/v

pH

GEL DE SÍLICE

1: CHCl3/MeOH(17%)/NH3

2:2:1

2: fenol/H2O

75:25

CELULOSA MN 300

1: n-BuOH/Me2CO/Et2NH/H2O

10:10:2:5

12

2-. i-PrOH/HCOOH(99%)/ H2O

20:1:5

2.5

El siguiente esquema muestra el proceso a seguir.

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El revelado puede hacerse con ninhidrina o por fluorescencia.

- Cromatografía de intercambio iónico (cii).

Se realiza a 50°Ccon las siguientes condiciones y resultados. Ver cuadro de datos.

pH

Columna (cm)

Citrato Na (N)

Orden de salida

Ve (mL)

3.25

150

0.2

Asp, Tre, Ser, Glu, Pro

225

4.25

150

0.2

Gln,Ala,Cis,Val,Met,Ile,Leu,Tir,Fen

440

5.28

15

0.35

Trp, Lis, His, NH3, Arg

125

Los AA se separan dentro de la columna en función de la atracción o repulsión por parte de la resina y del arrastre de la fase móvil. Los AA más negativos salen primero dejando a los más positivos por último, cuando la resina es catiónica. Dentro de cada grupo, la separación depende de la polaridad, solubilidad y forma molecular de cada AA. Aunque esta cromatografía se realiza manualmente, el proceso automatizado y programable ha cobrado popularidad.

La versión de HPLC (High Performance Liquid Chromatography) y UPLC se utilizan con mucha frecuencia por ser más resolutivas, rápidas, eficaces y sensibles (5 – 10 pmol de AA), aunque más costosas. La matriz está conformada por partículas más pequeñas, tamaño uniforme y el empaquetamiento es más fuerte. A su salida de la columna, los AA son transformados en derivados que después de su detección son cuantificados por métodos que utilizan ITF, cloruro de dansilo, cloruro de DABS, o-ftalaldehído/β-ME y ninhidrina, entre otros.

[pic 18]

- Electroforesis (EF).

Es el movimiento de especies químicas cargadas cuando son sometidas a un campo eléctrico. Se utiliza porque posee dos ventajas sobresalientes sobre la cromatografía: no afecta la estructura nativa de la molécula y es muy sensible a pequeñas diferencias en carga eléctrica, masa y forma molecular. La EF puede realizarse en papel (celulosa o acetato de celulosa; para moléculas cuyo PM μ), o sea, cuánto se desplaza desde el origen hasta el electrodo correspondiente es: μ = -∆P/PM. Si se realizara una EF a pH 6 para una mezcla que contiene Cis, Glu, Gli y Lis, se observaría lo siguiente:

AA

pHi

∆P

(μ)

Lis

9.74

+ 3.74

- 0.026

Gli

5.97

- 0.03

+ 0.0004

Glu

3.22

- 2.78

+ 0.019

Cis

6.02

+ 0.02

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