DETERMINACIÓN DEL AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE (MÉTODO DE SANGER)

...

Se lleva a desecación para eliminar exceso de éter.

Se re suspende con alcohol etílico (solvente no polar y de fácil evaporación).

Esta solución se coloca en un papel para cromatografía junto con diversas muestras de aminoácido dinitrofenilados.

Se deja correr la fase móvil aproximadamente 5 horas; al retirar se debe marcar inmediatamente la marca de solvente, ya que al secarse no se podrá observar hasta dónde llegó éste y es necesario para los cálculos de Rf.

Al dejar secar y observar el cromatograma se marcan las manchas significativas de cada una de las muestras; el Rf se calcula midiendo la distancia desde donde se colocó la muestra hasta el centro de la mancha y dividirla entre la distancia desde donde se colocó la muestra hasta donde se observa la línea de solvente previamente marcado.

De acuerdo a los resultados obtenidos, el problema 1 corresponde a al compuesta Dinitrofluorobenceno; mientras que el problema 2 corresponde a la muestra del aminoácido Valina dinitrofenilado.

Este método es poco usado en la actualidad pero fue un precursor para la secuenciación de diferentes proteínas; un método que aún es utilizado por su eficiencia es llamado “Degradación de Edman”, el cual consiste en la degradación repetitiva de los péptidos a partir de una reacción con el grupo amino terminal libre y con fenilisotiocianato (PITC) en condiciones alcalinas suaves formando feniltiocarbamilo, el producto es entonces tratado con ácido fluorhídrico para liberar el aminoácido que ha reaccionado del resto de la cadena peptídica mediante la formación de un derivado de tiazolinona, el cual es convertido a un derivado más estable (un aminoácido PHT) por la adición de TFA. Como consecuencia el péptido tiene ahora un nuevo residuo amino terminal listo para repetir el ciclo. La identificación de los PHT-aminoácidos es usualmente llevada a cabo por RP-HPLC.

Las diferencias entre ambos métodos nos llevan a mencionar las ventajas de la Degradación de Edman contra el Método de Sanger.

- Se pueden secuenciar hasta 50 aminoácidos, mientras que con Sanger se destruye el resto de la proteína a excepción de (los) el aminoácido(s) terminal(es).

- No requiere hidrólisis.

- Ahorro de material y reactivos.

- Menor tiempo en llevar a cabo la secuencia.

- CONCLUSIONES

- Dados los valores de Rf, el aminoácido terminal de la hemoglobina es Valina.

- El método de Sanger es útil para conocer el fundamento de las secuenciaciones de proteínas.

- La degradación de Edman se continua utilizando en la actualidad por su gran eficiencia, poco uso de material y reactivos, así como por su rapidez.

- Para poner de manifiesto la precisión de cualquier técnica es recomendable utilizar una proteína o péptido que bibliográficamente se conozca su composición y secuencia.

- PREGUNTAS EXTRA

- ¿Cómo se calcula el Rf en una cromatografía?

El Rf se calcula de la siguiente manera:

Rf= distancia recorrida por el producto/distancia recorrida por la fase móvil.

[pic 5]

- BIBLIOGRAFÍA

- http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/sintesis_de_peptidos.pdf SÍNTESIS DE PÉPTIDOS