Practica 2: Perdida del potencial de membrana mitocondrial y producción de ROS por citometría e flujo

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Discusión

1790553 Aguilar Vázquez David Salvador

Mediante la aplicación de Imatinib en conjunto con proteínas que lo liguen a las células se han obtenido valores aceptables de inhibición del crecimiento sobre la línea K-562 de leucemia mieloide aguda. Por otro lado, se ha querido comprobar si estos compuestos ejercen su efecto a través de la inducción de apoptosis y del arresto del ciclo celular en alguna de sus fases. Para ello, se ha probado el compuesto MD-35 sobre la línea CCRF-CEM de leucemia linfoblástica aguda de células t. No se ha podido demostrar ni la inducción de apoptosis ni el arresto del ciclo, no obteniéndose diferencias estadísticamente significativas entre las células tratadas y el cultivo control (Cascales, 2003). Esto concuerda con lo elaborado en la práctica, realmente no se aprecia una pérdida significativa del potencial de membrana mitocondrial si nos basamos meramente en lo observado en las gráficas. Se observar un efecto muy similar para las distintas concentraciones de Imatinib y para ETO.

Se han identificado ambas líneas como posibles agentes responsables de la aceleración del proceso de apoptosis al inducirse en ratones. Por lo cual la pérdida del potencial de membrana se ve fuertemente ligado con este proceso, al ser insuficiente la carga en mitocondrias estas pueden llevar a la célula a morir por apoptosis o incluso a realizar el proceso de autofagia (Ibanez et al., 2011). Se observó que al tratar las dos líneas celulares hay diferencias significativas entre la actividad de la membrana mitocondrial que hay en la línea CEM y la línea K-562, esto se puede deber a 2 motivos principales, la agresividad del tipo de cáncer que se esté tratando, ya que uno puede proliferar más rápido así como también se puede deber a una mayor producción de ROS, de ser por esto bien se podría identificar con la tinción por DCFDA, el cual es un tinte fluorogénico que mide la actividad hidroxilo, peroxilo y otras especies de oxígeno reactivo (ROS) dentro de la célula. Después de la difusión en la célula, DCFDA / H2DCFDA se desacetila mediante esterasas celulares a un compuesto no fluorescente, que luego se oxida con ROS en 2 ', 7' - diclorofluoresceína (DCF). El DCF es un compuesto altamente fluorescente que puede detectarse mediante espectroscopía de fluorescencia con espectros de excitación y emisión máximos de 495 nm y 529 nm, respectivamente (Yang et al, 2017). El detectar la actividad de ROS puede ser importante para el tratamiento de diferentes tipos de leucemia ya que puede ayudar a buscar métodos que reduzcan su producción y así evitar dirigir a las células hacia la apoptosis acelerada, debida a la metástasis de células cancerígenas.

1616505 Castillo Luna José Alfredo

1662143 Contreras Puente Rogelio

Se realizó una citometria de flujo a células de la línea celular K562 en la que se mostró una amplia efectividad conforme se agregaban más µM de IMATINIB y una casi nula efectividad en células tratadas con etopósido (quimioterapia utilizada en algunos tipos de leucemia) 10 µM por 24hrs, se observó cómo entre más alta era la concentración del tratamiento con IMATINIB, menor era la diferencia entre morfología así como la complejidad del evento (número de células) y al observar mediante luz ultravioleta estas células marcadas con TMRE un marcador específico para mito contra se observó una disminución en mitocondrias activas apoyando lo mencionado por Monzón (2007) que menciona que la respuesta citogenética en células de leucemia es alta, mientras que en las células CEM se notó una mayor efectividad en el tratamiento con etopósido y un aumento en la actividad con el IMATINIB ya que este tiende a ignorar estas células por lo que se aumenta el recuento de glóbulos blancos (en el que se incluyen las CEM).

El hecho de que se vea una disminución en mitocondrias activas se liga a la perdida de energía ya que al no estar activas no se lleva a cabo el proceso de la cadena de transporte de electrones y al verse afectada esta los ROS pueden causar daños en la célula e inducir una apoptosis (Ruth Sánchez, 2008) lo cual se expresaría en una gráfica un aumento de células marcadas con DCFDA cuando se aumentan las células sin mitocondrias activas.

La razón por la que las líneas celulares presentaron resultados diferentes, es debido a que las células CME que son células T linfoblastoideas no son afectadas en un tratamiento con IMATINIB ya que este va dirigido a tirosina quinasa BCR-ABL mutante en celulas CLM (Francisco Cervantes, 2008)

1677923 Moreno Garza Adrián Marín

En las diferentes concentraciones del tratamiento con IMATINIB se observan que no hay cambios significativos en las gráficas con respecto al control, esto significa que en realidad no hay muerte celular, este tipo de resistencia o más bien que el tratamiento no actué cobre las CEM es sobre la presencia del cromosoma Phliladelphia (Iqbal, 2014). El IMATINIB actúa sobre leucemias mieloides crónicas (CML) las cuales presentan un gen BCR-ABL y es sobre este donde actúa el tratamiento.

Con respecto a la gráfica de TMRE la mayor cantidad de células se mantuvo del lado derecho, es decir, que mantuvieron su potencial de membrana mitocondrial. Como indica Joshi (2011) el TMRE se acumula en el interior de alta carga negativa de las mitocondrias por lo cual cuando una célula no mantenga su potencial de membrana mitocondrial se verá representada del lado izquierdo como se observa en el tratamiento ETO la cual logro inhibir la mitad de las células. Con respecto a la gráfica de TMRE se puede deducir que el marcaje con DCFDA, si es que hubo muerte celular, se expresaría de lado izquierdo sin embargo como no hubo muerte celular en los tratamientos no se expresaría tanto el DCFDA de acuerdo a las ROS.

Como ya antes mencionado a diferencia de resultados entre ambas líneas celulares se da porque una representa el cromosoma philadelphia como ya antes mencionado, en el cual no puede actuar el IMATINIB, en cambio como la línea celular k562 pertenece a la leucemia mieloide aguda, contiene el gen ABL el cual es el que se inhibe por el IMATINIB. Esto es importante ya que se da a conocer más acerca de cómo actúa cada tipo de cáncer con respecto a sus genes. (Iqbal, 2014).

1657345 Olalde Garza Esther Andrea

En esta práctica fueron comparadas la línea celular CEM con la línea celular K562. A ambas líneas celulares se les aplicaron los mismos tratamientos, en los resultados se observa el grupo control