Producción de carne in vitro

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El objetivo principal de este proyecto es poder conseguir una tecnología que nos permita producir carne a partir del cultivo de células. A su vez, este objetivo principal se divide en otros más concretos:

• Conseguir una fuente de calidad de células madre y de células musculares, ya que repercutirá en las características de la carne que vamos a producir. Que estén libres de enfermedades y defectos genéticos.

• Diferenciar las células musculares a miocitos sin que se diferencie en otros linajes celulares, nos nos interesa que otras células puedan interferir y altere el producto final.

• Realizar un escalamiento que nos permita conocer los volúmenes y condiciones óptimas para que las células crezcan en un biorreactor y produzca carne en mayor cantidad y más rápidamente.

• Realizar un tratamiento para acondicionar la carne (prensado, acondicionamiento,…), y que pueda ser comercializada.

Diseño del estudio: Materiales y métodos

Nuestro objetivo es obtener carne de vaca a escala de un biorreactor, los pasos a seguir son los siguientes: elección de la fuente de células madre, obtención y aislamiento de las células madre, proliferación y diferenciación, escalado a nivel de biorreactor y su posterior tratamiento.

Fuente de células

Es esencial escoger una fuente de células correcta. Las células madre son las más prometedoras ya que, en teoría, se pueden dividir indefinidamente manteniendo su capacidad de diferenciarse en un determinado fenotipo. (Boonen, 2009)

Las células madres que de manera natural se diferencian en músculo son las células madre satélite, y por ello, será este tipo de célula la que escogeremos para la producción de carne in vitro. En concreto se usarán las células ADSCs que son células madre multipotentes que se encuentran en el tejido adiposo de la vaca, que serán obtenidas mediante una biopsia al animal. (Z.F. Bhat, 2011)

Obtención y aislamiento de células

El primer paso es la realización de una biopsia donde serán extraídas las células ADSC. Para aislar dichas células es necesario tratarlas con colagenasa tipo B y dispasa II. (Atsushi Asakura, 2001), posteriormente se pasará el músculo por pipetas disminuyendo el diámetro de la muestra, usando un medio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle médium) que contiene un 20% de suero fetal bovino, 10% suero de caballo y antibióticos: penicilina (100,000 IU/L) y estreptomicina (100 mg/L) y 4 mM de L-Glutamina. Obtendremos una suspensión de fibra, que se triturarán a 19G durante 5 minutos haciéndolas pasar por un tamiz celular. Añadiremos 10% de DMSO y se congelarán las muestras en nitrógeno líquido para su conservación (Boonen, 2009).

Proliferación y diferenciación

Este es sin duda el paso clave del proyecto, ya que existen múltiples factores que intervienen en el desarrollo adecuado de las células como se verá a continuación. Las células madre in vivo se encuentran en las condiciones óptimas por lo que nuestro objetivo es el de emular las condiciones de su nicho: elección del medio, factores de crecimiento, estímulo eléctrico, estímulo mecánico.

El medio en el que las células proliferarán estará compuesto por: suero fetal bovino, suplementado con 20% FCS, 2.5 ng/ml basicFGF (factor de crecimiento), (Atsushi Asakura, 2001) además se habrá de añadir IGF ( Insuline-like Growth Factor) (Boonen, 2009).

Una vez proliferadas las células se procederá a su diferenciación en mioblastos mediante la deprivación del suero junto con la adición de TGF-β (Boonen, 2009) que es un agente fibrogénico importante, ya que aumenta la expresión de colágeno, fibronectina y proteoglicano.

Además está demostrado que la estimulación eléctrica mejora la diferenciación de miotubos en cadenas de miosina y el desarrollo de sarcómeros ya que simula el impulso nervioso (Marloes L.P. Langelaana, 2010). Por lo que se someterá a las células durante 48 horas a un voltaje de 10 V durante 6 ms a una frecuencia de 2 Hz. Se reemplazará el medio de cultivo a las 24 horas. Se comenzará la estimulación eléctrica pasados 11 días desde que se comenzó el proceso de diferenciación. (Boonen, 2009)

Otro aspecto importante que no solo afecta a la diferenciación sino también a la proliferación y diferenciación de las células musculares es la estimulación mecánica. Es un proceso complejo poco conocido conocido por el nombre de mecanotransducción pero está demostrado como hemos dicho que favorece ambos procesos en el cultivo (Marloes L.P. Langelaana, 2010). Por ello mediante el uso del dispositivo Flexcell® se agitará en rampa de 0-2% durante 2 días, seguido de una agitación en rampa de 0-6% durante un ciclo intermitente on/off de 3 horas (Boonen, 2009).

La carne que estamos acostumbrados a comer, no solo está compuesta por mioblastos, por lo que llegados a este punto del proyecto se ha habrá de realizar un co-cultivo con fibroblastos, que producen una gran matriz extracelular (los mioblastos apenas producen matriz) y además de lipocitos, ya que la carne tiene grasa. Se ha de tener especial cuidado en este paso, ya que los fibroblastos tienen una capacidad superior de crecimiento a los mioblastos suponiendo un riesgo importante para el éxito del trabajo (Marloes L.P. Langelaana, 2010) (Boonen, 2009) (Z.F. Bhat, 2011).

Escalado

Esta es una tarea dificultosa ya que las investigaciones en el tema se han quedado a nivel de placas Petri, pero si nuestro objetivo es producir carne a escala industrial es necesario diseñar y construir un biorreactor que tenga en cuenta los siguientes parámetros (Z.F. Bhat, 2011):

- Mantener fuerzas de cizallamiento bajas.

- Es necesario un sistema que aporte un estímulo mecánico.

- Es necesario un dispositivo que aporte un estímulo eléctrico.

- Se han de considerar las distintas velocidades de crecimiento de células satélites y células que se usen en co-cultivo: lipocitos y fibroblastos.

- Es necesario altos coeficientes de trasferencia de materia.

- Establecer un caudal de alimentación

Existen dos tipos de biorreactores que cumplen los principales requerimientos (fuerzas de cizallamiento bajas y un elevado flujo de materia): Biorreactores de vaso de pared rotatorios y