Materiales y métodos

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La técnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas:

- Las muestras se someten a una separación electroforética.

- Terminada la electroforesis, las proteínas interaccionan con los Acs específicos aplicados en el agar en un canal paralelo al eje de migración. Luego de un período de difusión de los Acs, se observan arcos de precipitación cuya forma y posición dependen de las características inmunoquímicas y de la concentración de cada proteína.

Solución tampón

- buffer Tris-barbital 4X

- éter de ácido barbitoric 22,4 g

- tris base 44,3 g

- lactato de calcio 0,53 g

el volumen fue hecha con 1000 ml de agua destilada y el ajuste del pH no era necesaria.

Se diluye en la proporción de 1:4 antes de su uso. Buffer tanque fue agregado desde ambos lados de la cámara alcanza bajo el gel donde el gel estaba en el medio de la sala.

[pic 4]

Luego papel Whatman fue usado como puente entre el gel y el búfer para conectarlos. 5 ul de antígeno fue agregada a un bien en la parte superior derecha y se marcan como ánodo. La inmunoelectroforesis se llevó a cabo en la corriente de 6 mA o 120 V durante 45 min. Luego 15 ul anticuerpo en 50 ul buffer Tris-barbital fue agregado por estría, se incubaron en cámara húmeda a la temperatura del refrigeración durante la noche y se tiñen con azul de Coomassie. (Fig. 4).

[pic 5]

Fig. 4 inmunoelectroforesis: desviación de línea precipitada hacia el anticuerpo indica el complemento de antígenos con anticuerpos producidos; prolongadas precipitaciones es debido a la presencia de impurezas.

SDS-PAGE:

Es el acrónimo en inglés de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico). Es una técnica ampliamente utilizada en bioquímica, genética, biología molecular y ciencia forense para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética (en función de la longitud de la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros factores). Gracias al SDS las proteínas se desnaturalizan, perdiendo su conformación tridimensional. De este modo se obtiene un fraccionamiento que obedece a: la diferencia de peso; la longitud de la cadena (tamaño); y la forma de la proteína. Es el método de electroforesis empleado con mayor profusión para analizar proteínas.

Es un método cualitativo y cuantitativo.

Diferentes concentraciones de antígeno varió de 5 a 30 ul (en el intervalo de 5 ul) fueron utilizados. La mejor banda fue obtenida con 5 ul tras la tinción de concentración de antígeno (Fig. 5).

[pic 6]

Fig. 5 PAGE-SDS: 5, 10, 15, 20, 25 ul del factor VIII

Referencias bibliográficas

- TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS IV disponible en: http://pendientedemigracion.ucm.es/info/saniani/troncales/inmunologia/documentostemas/Tema%2013.pdf

- Identificación de proteínas por inmunoelectroforesis, Disponible en: http://cuadernodepracticasdebioquimica.blogspot.pe/2015/12/identificacion-de-proteinas-por.html

- Dra.Hilda Marilín García Pérez, Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia, LABORATORIOS BETERÁ, UNIV DIAG 2000;1(2):31-41