A medida que se empezaba a saber más sobre esta la celula eucarionte, comenzaron a elaborarse diferentes métodos para estudiar los componentes estructurales y funcionales de esta.

...

- Figura 2:

[pic 3]

Título de muestra: Solución de pellet del tubo HC + 1ml de suero fisiológico.

Tipo de muestra: temporal

Tinción: azul de tripano

Aumento objetivo: 40x

Aumento total: 400x

Observaciones: se pueden observar varias circunferencias de color azul, algunas más oscuras que otras. Se puede confirmar la suposición de que las circunferencias son núcleos, ya que la tinción ocupada (azul de tripano) es utilizada para reconocer membranas celulares y nucleares en muestras de microscopio.

Actividad A 2.2

- Tabla N°1:

N°

Muestra

Succinato

0.1M

Azul de metileno

Agua destilada

HC

FN

FMit.

FMic.

Observaciones, reacción (+) o (-)

1

Blanco

1mL

1mL

1mL

Muestra de control

2

Homogeneizado crudo (HC)

1mL

1mL

1mL

1mL

Reacción 5(+)

Se puede observar que al agregar 1 ml de homogenizado crudo (tubo HC) la muestra cambia

totalmente al color original del homogenizado crudo (color marrón)

3

Fracción Nuclear (FN)

1mL

1mL

1mL

1mL

Reacción: (+)

Se observa que al agregar 1 ml de fracción nuclear ocurre un oscurecimiento de la muestra.

4

Fracción Mitocondrial (FMit.)

1mL

1mL

1mL

1mL

Reacción: 2(+)

Se puede apreciar que la muestra se oscurece aún más (comparada con la muestra n°3)

5

Fracción Microsomal (FMic.)

1mL

1mL

1mL

1mL

Reacción: (-)

No se observa ningún cambio de coloración, por lo que se asume que no hubo reacción alguna.

- Observación post-baño termorregulador: Después de dejar reposar por 10 minutos las 5 muestras en un baño termorregulador a 37°C se pudo observar que todas la muestras presentaron una decoloración considerable (incluida la muestra de control), en comparación con cada una de las muestras, los tubos n°2 y n°4 fueron las de menor y mayor decoloración respectivamente.

DISCUSIÓN

El fraccionamiento subcelular que se realizó en este práctico puede diferenciarse en 2 grandes etapas; el homogeneizado y/o ruptura; y los fraccionamientos. Siendo esta última realizada mediante centrifugados seriados en las muestras. Cada centrifugado tenía una duración establecida según el tipo de estructura que se quiera aislar, Cabe señalar que estas centrifugaciones se hacen a una temperatura de 4°C, para prevenir la degradación de las estructuras celulares presentes (6). La primera muestra fue centrifugada por 10 minutos a 2500 RPM aprox.

De esta centrifugación se obtuvo un sobrenadante, el cual fue puesto en otro tubo para ser centrifugado, y pellet; el cual, en esta ocasión, estaba formado por núcleos. Se prosiguió tomando 2 muestras del pellet, A la primera se le dejo sin nada, en cambio a la segunda se le agregó azul de tripano, tinción que actúa sobre los núcleos (7), Se observaban claramente los núcleos presentes, los cuales eran azules profundos debido a la tinción del reactivo, además se veían algunas pequeñas pequeños manchones celestes los cuales eran núcleos, los cuales estaban rotos.

Como se señaló anteriormente, el sobrenadante de la muestra se puso a centrifugar, pero esta vez a 6000 RPM aprox. Por 20 minutos a la misma temperatura anterior (la temperatura se mantiene igual en todos los centrifugados). Como se puede observar, las revoluciones por minuto (RPM) aumentan, esto se debe a que las estructuras que se pretende obtener tienen una menor densidad y tamaño que el núcleo. En el pellet que se sedimenta en el fondo del tubo Falcon se puede saber, por el tiempo y las RPM que se aplicaron en la centrifuga, que en este se encuentran concentradas mitocondrias y lisosomas (8). El sobrenadante se lleva nuevamente a centrifugación a 6000 RPM durante 20 min.

De esta centrifugación, el pellet que se obtiene corresponde a vesículas de R.E.G (microsomas). Ya terminadas las centrifugaciones se desecha el último sobrenadante. Cabe señalar que cada uno de los pellets fue suspendido con 1mL de suero frio y mantenidos en hielo.

Como última actividad del práctico se pusieron los fraccionamientos antes obtenidos en 4 tubos de ensayo, además se puso un 5° tubo de ensayo como grupo de control. A cada uno de estos tubos se les agregó 1Ml de Succinato 0,1M; 1mL de azul de metileno y 1mL de agua destilada.

Al momento de agregar todas los fraccionamientos antes obtenidos, cuidando de dejar