Aplicaciones de la biologia molecular en la tuberculosis

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Tanto la sensibilidad como la especificidad del ensayo son excelentes. Sin emargo, son varios los inconvenientes que han hecho que en la actualidad su uso haya disminuido a favor de otras técnicas moleculares. En primer lugar, la necesidad de disponer de un aislado previo, ya que la técnica carece de la sensibilidad suficiente para detectar micobacterias directamente sobre la muestra clínica. Por otro lado, el número de sondas comercializadas es limitado (aunque incluye las más importantes desde el punto de vista clínico) y requiere una orientación presuntiva (p.e. según el aspecto de la colonia) para la elección de la sonda adecuada, ya que sólo se puede emplear una por reacción. Por último, la sonda es incapaz de detectar cultivos mixtos micobacterianos que pueden presentarse con relativa frecuencia en individuos inmunocomprometidos (Alcaide, 2006).

- ENSAYOS DE AMPLIFICACIÓN GENÉTICA CON DETECCIÓN AUTOMÁTICA/SEMIAUTOMÁTICA

Las técnicas de amplificación genética han revolucionado el diagnóstico microbiológico. De esta técnica, la más conocida es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La realización de una reacción de amplificación genética consta de tres etapas: 1) extracción de los ácidos nucleicos, 2) amplificación de la secuencia diana, y 3) detección de los fragmentos amplificados. En el caso de las micobacterias, la extracción de ácidos nucleicos es simple si se realiza a partir de cultivos tanto sólidos como líquidos, donde existe una gran cantidad de ADN. Por el contrario, el rendimiento de la extracción es bajo si se parte directamente de una muestra clínica, debido a que la cantidad de ADN disponible es inferior, lo que puede comprometer la sensibilidad de la técnica (Nolte y Caliendo, 2007).

La amplificación del fragmento diana de ácido nucleico, en el caso de la PCR convencional, se lleva a cabo mediante sucesivos ciclos de desnaturalización y naturalización del ADN. Este proceso se realiza mediante cambios de temperatura y requiere de un termociclador. La separación de las hebras permite que una enzima termoestable (Taq polimerasa) vaya formando copias de la diana genética de forma exponencial en cada ciclo. La amplificación tiene lugar en aproximadamente dos horas.

El producto amplificado se puede detectar de diversas formas. En las PCR caseras se recurre a la observación directa del fragmento amplificado en un gel de agarosa, tras una electroforesis convencional. No obstante, este método no es suficientemente específico ya que tenemos que asegurarnos que el producto amplificado se corresponde con nuestra diana. Para ello se realiza una hibridación con una sonda que sea complementaria a la diana amplificada (Alcaide, 2009).

Según Alcaide, 2005; El desarrollo de estas nuevas técnicas de amplificación genética tenía como objetivo la detección de M. tuberculosis directamente de la muestra clínica. Diversos estudios han demostrado que la especificidad de estos ensayos es aceptable tanto en muestras respiratorias como extrapulmonares. Sin embargo, la sensibilidad es variable, siendo muy buena en muestras respiratorias con baciloscopia positiva (88- 100%), menor cuando la baciloscopia es negativa (50- 96%) e impredecible entre las muestras extrarrespiratorias (27,5-85%).

- ENSAYOS DE SONDAS EN LÍNEA

Esta tecnología se basa en la realización de una PCR en la que la detección del producto se realiza en tiras de nitrocelulosa marcadas con sondas específicas para las diferentes especies de micobacterias. Por lo tanto permite realizar la identificación en una única reacción. Además, tiene la ventaja de que este formato de tiras es de fácil lectura e interpretación. Actualmente se dispone de dos sistemas comercializados: “INNO-LiPA v2” y “GenoType”. El “INNO- LiPA” v2 tiene como diana de amplificación un fragmento del espacio intergenético 16S-23S del ARNr e incluye 16 sondas diferentes que permiten la identificación del complejo M. tuberculosis y de las especies de micobacterias no tuberculosas de mayor interés clínico (Alcaide 2009).

Por su parte el sistema “GenoType” amplifica el gen 23S del ARNr; y existen diversas tiras para diferentes niveles de identificación. Un primer formato de tiras (“GenoType CM”) permite la identificación del complejo M. tuberculosis junto con otras 13 especies de micobacterias implicadas más frecuentemente en clínica. Si no se llega a un diagnóstico, existe otro formato (“GenoType AS”) que incluye 16 especies adicionales. Por último, existe un tercera tira (“GenoType MTB”) para la identificación de las especies que forman el complejo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti y M. canetti) (Alcaide, 2005) .

Los ensayos de sondas en línea presentan una buena sensibilidad y especificidad a partir de aislados de cultivos, y también ha demostrado ser útil en la detección directa sobre

muestras respiratorias con baciloscopia positiva; sin embargo, no se recomienda su utilización si la baciloscopia es negativa. Estas técnicas se realizan en 1-2 días de trabajo y su diseño permite el diagnóstico de coinfecciones. Entre sus inconvenientes, hay que señalar que son pruebas caras y relativamente laboriosas (Balasingham et al., 2009).

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La sensibilidad de este ensayo para la detección de resistencias a estos fármacos está en torno al 88%, excepto para el etambutol para el que disminuye notablemente (38,5%). Dicho ensayo ha obtenido un buen rendimiento tanto en las cepas aisladas de cultivo como sobre muestras respiratorias con baciloscopia positiva, aunque por el momento los estudios realizados son todavía escasos (Hillemann et al., 2009).

Los ensayos moleculares para la detección de resistencias permiten disponer de información mucho más rápidamente en comparación con el antibiograma. Además, cuentan con la ventaja de que el resultado conseguido directamente de la muestra puede ser más representativo de la población bacilar del paciente que el obtenido por cultivo (Martin, 2010). No obstante, presenta importantes inconvenientes. El principal es que, con excepción de la rifampicina, no se conocen las alteraciones genéticas que causan entre el 20% y el 40% de las resistencias a la mayoría de los fármacos de primera línea. Otra limitación es la escasa sensibilidad que pudiesen tener estos ensayos en detectar poblaciones minoritarias resistentes (heterorresistencia) que causaran la resistencia fenotípica (Cuevas-Córdoba B y Zenteno-Cuevas, 2010).

DIAGNOSTICO ATRAVES DE TECNICAS DE RECIENTE INCORPORACION EN LA BIOLOGIA MOLECULAR.