Laboratorio de Biología Molecular

...

- ¿Qué carga superficial tiene la CMC activada?

Tendrá una carga negativa la CMC

- ¿Qué carga eléctrica tiene la lisozima al pH del tampón A ie mayor a su pl.?

Aun pH de 9.5- 10 la lisozima es prácticamente la única proteína con carga positiva neta.

- Explica que característica de la lisozima es la besa para esta purificación, es decir para separarla de otras proteínas en la mezcla.

La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse. La carga neta de la partícula está dada por el pH del medio y puede ser modificada por la interacción con pequeñas moléculas de iones u otras macromoléculas. De lo anterior se deduce que el pH influye sobre la velocidad de migración de las moléculas.2 En el punto isoeléctrico de la biomolécula, pH al cual su carga neta es 0, esta no migra. Por debajo del punto isoeléctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el cátodo, y por encima del punto isoeléctrico tienen carga neta negativa y migra hacia el ánodo.

- ¿Por qué se eluye la lisozima con el tampón B? ¿Cuál es el ion clave?

[pic 1]

- ¿Para que sirven los dos lavados del tampón A?

Para que su pH se estabilice y sea neutro

MATERIAL (practica 1)

- Tubo Falcon 50 ml

5 Tubos Eppendorf 1.5 ml

- Vortrex

- Probeta de 50 ml

- Vaso de precipitados 50 ml

- Pipetas 5 m

- Propipeta

- Espatula

REACTIVOS

Glicina

Hidróxido de Sodio

Ácido Clorhídrico

Fosfato de sodio monobásico

Fosfato de sodio dibasico heptahidratado

Cloruro de sodio

Carboximetil- Celulosa

PRACTICA 2. EFECTO DE LA TEMPERATURA Y DE LA REDUCCION DE LOS PUENTES DISULFURO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.

OBJETIVO.

Entender la contribución de un enlace de disulfuro y sus puentes de Hidrogeno al centro activo de la lisozima y la actividad de la enzima.

RESUMEN.

Los enzimas actúan de acuerdo con los mismos principios generales que los demás catalizadores: aumentan la velocidad de las reacciones químicas combinándose transitoriamente con los reactivos de manera que estos alcanzan un estado de transición con una energía de activación menor que el de la reacción no catalizada. Hay que destacar sin embargo que los enzimas son mucho más eficaces que cualquier catalizador artificial conocido. Se ha podido comprobar que los aumentos de velocidad que producen son de entre 107 y 1014 veces la velocidad de la reacción no catalizada. La actividad molecular (número de moléculas de sustrato transformadas por una sola molécula de enzima por minuto) de distintos enzimas oscila entre unos pocos miles y varios millones de moléculas de sustrato por minuto. Cabe preguntarse pues, cómo consiguen los enzimas aumentos tan espectaculares en la velocidad de las reacciones químicas que catalizan. Algunas enzimas actúan con la ayuda de estructuras no proteícas. En función de su naturaleza se denominan:

1.Cofactor: Cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas.

2.Coenzima: Cuando es una molécula orgánica.

Las coenzimas pueden participar también covalentemente en las reacciones. La conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica, pH óptimo. La temperatura òptima donde la actividad catalítica es máxima; por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

MATERIAL (PRACTICA 2)

- 2 celdas p/espectro

- espectofometro

- 5 E P pendedores

- Pizeta

PROTOCOLO

- 450nm f0/f1

- calibrar el buffer fosfato

- ABS suspensión bacterial

- Agregar 100 ml

- Leer absorbancia T1=2 MIN T2= 7 MIN

BIBLIOGRAFIA

- BOLSEVER STEPHENR., HYAMS JEREMY. S, SHEPHARD ELIZABETH A., WHITE HUGH A., WIEDEMMAN CLAUDIA G. 2004 BIOLOGIA CELULAR. ACRIBIA, S.A. ZARAGOZA ESPAÑA. p 181-184

- CURTIS, BARNES, SCHNEK, MASSARIN. 2013. BIOLOGIA. PANAMERICANA. MADRID. Pp 321-323

- LEHNIGER.ARBET L. 1993. PRONCIPIOS DE BIOQUIMICA. OMEGA. BARCELONA. Pp 136, 142, 179, 180.

- STRIYER LUBERT, BERG M. JEREMY Y TYMOCZKO L JHON. 2013. BIOQUIMICA CON APLICACIONES CLINICAS. REVERTE. BARCELONA. pp 219-227

RESULTADOS

CONCLUSIONES (practica 1 y 2)

Mediante la cromatografía comprobamos que la enzima lisozima de la clara de huevo es más fácil de separar ya que observamos la disminución la actividad bacteriana (en la practica 1 no terminamos toda la practica ya que solo llegamos a la centrifugación y no obtuvimos la absorbancia de cada fracción F0, F1, F2, F3 ). En la práctica 2 de acuerdo a los resultados obtenidos durante cada absorbancia la longitud de onda fija 450nm, debido