CUESTIONARIO PREVIO Práctica 5. Electroforesis de DNA

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- Utilidad del marcador de peso molecular.

Se puede obtener una estimación de la masa molecular de proteínas (en kDa) y de fragmentos de DNA (en pb) empleando la electroforesis en agarosa. En ambos casos, en uno de los pocillos del gel se carga una mezcla de moléculas patrón de tamaño o peso conocido, con el fin de poder trazar la curva de calibración, por ello, la utilización de un marcador de peso molecular es fundamental para tener una referencia de los tamaños del DNA en las muestras. Algunos de los más utilizados son: Lambda 1 kb ladder, GeneRuler 50 bp DNA Ladder, y DNA del fago lambda digerido con la enzima de restricción HindIII.

- Fundamento de la tinción con bromuro de etidio y GelRed.

- Bromuro de etidio: El bromuro de etidio (EtBr) es un agente intercalante (se intercala entre las bases nitrogenadas) que se usa como colorante fluorescente para la visualización de ácidos nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida. El EtBr absorbe luz ultravioleta de λ= 300 nm, y emite una luz anaranjada de 590 nm, mediante la cual podemos observar la posición y cantidad relativa del DNA en el gel tras la electroforesis, utilizando una lámpara UV. Tiene la desventaja de ser altamente tóxico, y por tanto requiere tratamiento para su desecho, además de representar un riesgo para el usuario.

- GelRed: Gel Red es un tinte fluorescente que se intercala entre las bases nitrogenadas del DNA y puede ser iluminado con luz ultravioleta. Este tinte pertenece a un conjunto de colorantes diseñados como una alternativa al bromuro de etidio, pues presentan una baja toxicidad, no son mutagénicos ya que no tienen la capacidad de atravesar las membranas celulares (mientras que el EtBr sí), son altamente estables, y son compatibles con todas las aplicaciones de rutina postelectroforesis tales como la digestión con enzimas de restricción, entre otras. Se puede desechar directamente en el drenaje o en la basura regular.

Referencias:

- “Electroforesis de proteínas y de ácidos nucleicos”. (s.f.). Consultado el 19 de marzo de 2016 en http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

- Fierro, F. (s.f.). “Electroforesis de ADN”. Consultado el 19 de marzo de 2016 en http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf

- García, H. (2001). “Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia”. Laboratorios Beterá Univ Diag, 1(2):31-41. Consultado el 19 de marzo de 2016 en http://bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.pdf

- Laboratorio de Genómica Viral y Humana de la UASLP. (2008). “Preparación de Geles de Agarosa para Electroforesis”. Consultado el 19 de marzo de 2016 en http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Mol_GelAgarosa.pdf

- Lomonte, B. (s.f.). “Electroforesis en Gel de Poliacrilamida”. Consultado el 19 de marzo de 2016 en http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-bioq-gen/archivos/Lomonte%20-%20Cap13%20PAGE.pdf

- Microkit: Medios de Cultivo. (s.f.). “Agarosa”. Consultado el 19 de marzo de 2016 en http://www.medioscultivo.com/agarosa/

- Probiotek. (s.f.). “GelRed Nucleic Acid Gel Stain”. Consultado el 19 de marzo de 2016 en http://www.probiotek.com/producto/gelred-nucleic-acid-gel-stain-10000x/

- Uribe, T., et.al. (2013). “Uso Alternativo del Colorante GelRed en la Tinción de Ácidos Nucleicos”. Archivos de Medicina, 13(2):160-166. Consultado el 19 de marzo de 2016 en http://www.umanizales.edu.co/publicaciones/campos/medicina/archivos_medicina/html/publicaciones/edicion_13-2/13-2-5.pdf