Como Identificar y conocer los conceptos de homogeneización, filtración y centrifugación

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FLUORESCENCIA

1. Coger otra lamina.

2. Adicionar 10 µl del colorante Hoechst 33258.

3. Cubrir con una lámina cubreobjeto.

4. Dejar reposar por 2 minutos.

5. Observe a través microscopio de fluorescencia.

6. Esquematizar.

• Fracción mitocondrias

1. Tomar el tubo marcado como mitocondrias

2. Adicionar 5 µl del resuspendido y 5 µl del colorante mytotracker a un ependorf de 0,5 ml.

3. Dejar por 10 minutos a 37°C hasta que se incube.

4. Ejecutar la misma aplicación con otro ependorf de 0,5 µl.

5. Adicionar 5 µl del colorante verde de Janus.

6. Realizar un frotis.

7. Observar a través del microscopio de fluorescencia y de campo claro.

8. Esquematizar a 400X.

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

Para poder evaluar el fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares, primero se coloco en un tubo ependorf de 1,5ml lo obtenido del hígado de pollo con la fase de filtración; Lo colocamos en el tubo con la ayuda de la micropipeta para obtener una medida exacta de 250 ml . Continuamos agregándole el buffer Tris 10Mm Ph 7,5 pues esto se usa en todo proceso de extracción de ADN ya que es sensible al pH de cualquier tipo de fuente durante dicho proceso. Además, La solución Tris se utiliza durante la lisis celular, la eliminación y la precipitación de componentes celulares no deseados para mantener un pH estable. Luego lo colocamos a la centrifuga por 5 minutos, ahí conseguimos ver un sobrenadante y un precipitado; el cual separamos el sobrenadante en otro tubo ependorf de 1,5ml el cual lo marcamos como N1. Se realiza otro segundo centrifugado de 12 minutos, pero solo con el tubo que contiene el precipitado y aquí obtuvimos nuestra segunda muestra que marcamos como M1.

Al ya tener las dos muestras, realizamos lo siguiente que era la observación en el microscopio.

-Se tomó una gota de la muestra N1, y se le agregó una gota de azul de metileno, el cual con el objetivo de 40X realizando un aumento de 400X se logró observar un fondo azul claro con puntos pequeños de color azul intenso. Estos resultados se obtuvieron debido al azul de metileno, que se le conoce como un colorante en las tinciones para la observación del microscopio, y fue que logramos reconocer el núcleo en esta muestra.

Luego le agregamos a esta muestra el aceite de inmersión y llegamos a ver en la muestra más claro el núcleo y con nucleoides.

-Se tomó una gota de la muestra M1, y se le agrego Verde de Janus, el cual con el objetivo de 40X realizando un aumento de 400X se logró observar unos puntos con bordes redondeados que eran las mitocondrias. Estos resultados se obtuvieron debido al Verde de Janus, que se le conoce como un colorante básico que se utiliza en la histología y colorear mitocondrias supra vital, y fue que logramos reconocer las mitocondrias en esta muestra.

CONCLUSIONES:

Nosotros concluimos que, al realizar el fraccionamiento celular, lo usamos para separar los distintos orgánulos y componentes celulares el cual hacemos su estudio. Pues se inicia con la homogeneización; donde el tejido se tritura dejando que las células se compriman y liberen su contenido. Luego ese extracto lo someto a diferentes centrifugaciones; las cuales logro realizar diferentes velocidades y tiempo; de manera que se obtienen fracciones enriquecidas de los distintos orgánulos.

Después de haber realizado todo el procedimiento se procedió a observar al microscopio todas las muestras, se tomó unas gotas del concentrado y se observó los resultados de las muestras, ahí logramos observar al núcleo y a las mitocondrias; gracias a nuestros colorantes: Azul de metileno y Verde de Janus.

Entonces así nos pudimos dar cuenta de cómo se lleva a cabo un proceso de fraccionamiento celular.