Crecimiento folicular en ovarios bovino y desarrollo correlacionado con la expresión de ácido lipofosfatídico

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2.3. Extracción total de ARN, transcripción reversa (RT) y PCR en tiempo real

La capa de teca se homogeneizó antes de la extracción de ARN. El ARN total se extrajo de acuerdo con el protocolo del kit de aislamiento Total RNA Mini (A & A Biotechnology, # 031e100). Las muestras de ARN se almacenaron a -80°C. Antes del uso, el contenido y la calidad del ARN se evaluaron mediante medición espectrofotométrica. La cantidad de 500 ng de cada muestra de ARN total se transcribió de forma inversa (de acuerdo con el kit de síntesis de cDNA de First Strand para el protocolo RT-qPCR, Thermo Scientific, n. º K1642). La expresión de ARNm para las enzimas responsables de la síntesis de LPA (fosfolipasa A2ePLA2 y autotaxineAX), los receptores para LPA (LPAR1, LPAR2, LPAR3 y LPAR4) y los factores de importancia potencial para el proceso ovulatorio y el desarrollo del folículo preovulatorio (PGES, DBI, CD36, TFG, RABGAP1 y BTC) se midieron mediante PCR en tiempo real usando sondas TaqMan específicas.

La PCR en tiempo real se realizó con un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Life Technologies, EE. UU.) Usando la mezcla maestra de qPCR Maxima Probe / ROX (nº K0231, Thermo Scientific, EE. UU.). Las reacciones de PCR se realizaron en placas de 384 pocillos. Los resultados de la transcripción de ARNm se normalizaron a niveles de ARNm de beta-actina (ACTB, un control interno) y se expresaron como unidades arbitrarias. El gen de limpieza fue elegido utilizando el software NormFinder mediante la comparación de los siguientes dos genes candidatos: GAPDH y ACTB [32]. Los cebadores se diseñaron utilizando un paquete de software en línea (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm). Las secuencias de los cebadores y los tamaños de los fragmentos amplificados de todos los transcritos se muestran en la Tabla 1. Para la cuantificación relativa de los niveles de ARNm, se usó el software Miner (http://miner.ewindup.info).

2.4. Inmunohistoquímica

Para inmunolocalizar los factores implicados en el proceso de ovulación y el desarrollo folicular en el folículo ovárico bovino, los ovarios con folículos antrales se fijaron en formaldehído tamponado al 4% para inmunohistoquímica (según [33]). Las proteínas de interés se tiñeron con el uso de anticuerpos policlonales de cabra: anti-BTC, anti-DBI, anti-CD36 (dilución para todos los anticuerpos 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, # sc-5800, # sc-23474, #sc -5522, respectivamente), anti-PGES (dilución 1:50, Santa Cruz Biotechnology, # sc-32589), anti-TFG (dilución 1: 150, Abcam, # ab72126) y anti RABGAP1 (dilución 1: 200, Abcam, # ab153992). Las secciones de control negativo se incubaron con IgG irrelevante de cabra (concentración 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, # sc-2028).

2.5. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad PRISM v. 6.0 (GraphPad Software, Inc.). Todos los datos experimentales se muestran como la media ± SEM, y las diferencias se consideraron significativamente diferentes en el nivel de confianza del 95% (P

3. Resultados

3.1. La expresión de PGES, BTC, DBI, CD36, RABGAP1 y TFG en las células de la granulosa de los folículos ováricos sano, transicional y atrésico

La abundancia de ARNm de todos los factores examinados se detectó en las células de la granulosa de los folículos ováricos sano, transicional y atrésico (Fig. 1). Los mayores niveles de expresión de ARNm se midieron para DBI y TFG. La abundancia de ARNm para DBI, RABGAP1 y TFG fue mayor en los folículos sanos en comparación con los folículos atrésicos (Fig. 1C, E, F, P 0,05).

3.2. La expresión de PGES, BTC, DBI, CD36, RABGAP1 y TFG en las células tecales de folículos ováricos sanos, transicionales y atrésicos.

Se detectaron niveles de expresión de ARNm de todos los factores examinados en folículos ováricos sanos, transitorios y atrésicos (Fig. 2).

Los mayores niveles de ARNm se revelaron para DBI y TFG. Las abundancias de ARNm de BTC y CD36 fueron menores en los folículos sanos en comparación con los atrésicos (Fig. 2B y D, P 0,05).

3.3. La localización inmunohistoquímica de PGES, BTC, DBI, CD36, RABGAP1 y TFG en folículos ováricos bovinos

La inmunolocalización de los factores implicados en el crecimiento folicular, el desarrollo y la ovulación se examinaron en folículos ováricos bovinos. Las células granulosas y tecales de los folículos ováricos se inmunotiñeron positivamente para todas las moléculas analizadas (Fig. 3).

Se observó una inmunotinción fuerte para TFG (figura 5 A), DBI (figura 5B), RABGAP1 (figura 3D) y PGES (figura 3E) en células granulosas y tecales. Se encontró inmunotinción pálida para BTC (figura 5C) y CD36 (figura 5F). No se observó tinción positiva en la sección desprovista de anticuerpos primarios contra factores analizados o en secciones con anticuerpos inmateriales (control negativo, Fig. 3GeL).

3.4. Las correlaciones entre los niveles de expresión de ARNm de PGES, BTC, DBI, CD36, RABGAP1 y TFG y LPAR, PLA2 y AX en sano,

folículos ováricos transicionales y atrésicos Las correlaciones entre la abundancia de ARNm de los factores potencialmente asociados con la foliculogénesis y la ovulación, LPAR y enzimas que sintetizan LPA se investigaron en los diferentes tipos de folículos ováricos (Tabla 2). Todas las correlaciones encontradas tanto en la granulosa como en las células tecales fueron positivas. La intensidad de correlación se determinó por el valor de r (Tabla 2, Figuras 4e7). Las relaciones caracterizadas por r

Se encontró una correlación entre los niveles de expresión de ARNm para LPAR3-CD36 (Tabla 2, r = 0.7327, P

De las correlaciones entre la abundancia de ARNm de los factores examinados y AX, la correlación con LPAR1 y LPAR3 no se observó en las células de la granulosa de los folículos de transición. No se detectó ninguna relación entre los niveles de transcripción de LPAR, PLA2 y AX y los factores investigados en las células de la granulosa de los folículos clasificados como atrésicos.

En las células tecales de los folículos sanos (Fig. 6), encontramos numerosas correlaciones muy fuertes (0,81 0.05). Las correlaciones de los niveles de ARNm de DBI con PLA2 y LPAR2 fueron muy fuertes (Fig. 6C, r = 0.8644; Fig. 6F r = 0.8835, respectivamente;