Determinacion de nitritos.
Enviado por Sandra75 • 4 de Mayo de 2018 • 652 Palabras (3 Páginas) • 278 Visitas
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Las determinaciones se realizan por duplicado, en una placa para ELISA de 96 pocillos.
A cada pocillo, se agregó 200 µL de la sulfanilamida y 40 µL de las diferentes concentraciones de la sustancia patrón. Dejar incubar a temperatura ambiente de 8 a 10 minutos.
Posteriormente añadir 20 µL del de α- naftil -etilendiamina (NEDA), mezclar con cuidado, evitando la formación de burbujas). Leer a los 20 minutos a 540 nm. Graficar Absorbancia vs µM de nitrito de sodio.
Las determinaciones se realizan por duplicado, en una placa para ELISA de 96 pocillos.
A cada pocillo, se agregó 200 µL del Ácido Sulfanilico (Griess A) y 40 µL del sobrenadante de las muestras cuya cantidad de nitritos se desea determinar. Dejar incubar a temperatura ambiente de 8 a 10 minutos.
Posteriormente añadir 20 µL del de α- naftil -etilendiamina (NEDA), mezclar con cuidado, evitando la formación de burbujas.
Leer a los 20 minutos a una densidad óptica de 540 nm en un lector de placas. Las densidades ópticas se evaluaron automáticamente por el lector de ELISA, según la curva de calibración preparada para este experimento.
CÁLCULOS
De acuerdo a la interpolación realizada en la gráfica, y a las diluciones realizadas, calcule las µM de nitrito en la muestra.
Utilizando agua
Utilizando DMEM
Conc µM
Abs a540 nm
500
1.788
250
1.028
125
0.562
75
0.312
50
0.274
25
0.163
12.5
0.104
0
0.048
Conc µM
Abs a540 nm
125
0.592
75
0.378
50
0.272
25
0.163
12.5
0.108
0
0.054
Bibliografia
- Matthew J. Moorcroft, James Davis, Richard G. Compton, Detection and determination of nitrate and nitrite: a review, Talanta, Volume 54, Issue 5, 21 June 2001, Pages 785-803, ISSN 0039-9140, http://dx.doi.org/10.1016/S0039-9140(01)00323-X.
(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003991400100323X)
2- Lisa A. Ridnour, Julia E. Sim, Michael A. Hayward, David A. Wink, Sean M. Martin, Garry R. Buettner, Douglas R. Spitz, A Spectrophotometric Method for the Direct Detection and Quantitation of Nitric Oxide, Nitrite, and Nitrate in Cell Culture Media, Analytical Biochemistry, Volume 281, Issue 2, 1 June 2000, Pages 223-229, ISSN 0003-2697, http://dx.doi.org/10.1006/abio.2000.4583.
(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269700945834)
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