Facultad de Química y Farmacia ENZIMAS DE RESTRICCION.

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El uso de estas enzimas como herramienta biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las largas cadenas de ADN genómico para manipularse y analizarse en fragmentos más pequeños. El empleo de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican ácidos nucleicos, como la ligasa, permitió desarrollar la metodología del ADN recombinante.

- Origen de las enzimas de restricción

En 1960, Stewart Linny y Werner Arber aislaron, en E. coli, enzimas que metilaban moléculas de ADN y que ademas cortaban un enlace fosfodiéster del ADN no metilado. Más tarde, en 1970, se caracterizó la primera nucleasa de restricción por Daniel Nathans y Hamilton Smith, aislada de Haemophilus influenzae, denominada Hind I. En la actualidad, se sabe que todas las especies de bacterias sintetizan uno o más tipos de endonucleasas capaces de hacer cortes en secuencias específicas de nucleótidos de una doble cadena de ADN exógeno; generalmente, este ADN “extraño” es el proveniente de los bacteriófagos, virus con capacidad de infectar a dichas bacterias.

- Factores que afectan el trabajo de las enzimas de restricción

Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden afectar la actividad de las mismas:

1. Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.

2. Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad.

3. DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .

4. Contaminantes con carga (-).

5. DNA contaminado con otro DNA.

6. Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.

7. Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para la enzima).

8. Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones óptimas.

- Tipos de enzimas de restricción

Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción:

- Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.

- Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para clonación de genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP...

- Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.

2.5 Clasificación de las enzimas de restricción según el corte

Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena complementarios entre sí. Por otro lado, los extremos romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.

2.6 Mapas de restricción: propósito

En un experimento de cartografía por restricción de un plásmido, este DNA se corta con varias enzimas de restricción, solas y en parejas, para determinar el número de sitios de corte y sus posiciones relativas sobre el círculo plasmídico.

El DNA cortado (o digerido) se separa en un gel de agarosa y se determinan los tamaños de los fragmentos mediante comparación con los tamaños de moléculas conocidas (los "patrones") situadas en otra calle del gel.

Los fragmentos se organizan en forma de mapa comparando los tamaños de fragmentos en las calles donde se cortó con una sola enzima (digestiones simples) con los de las calles donde se cortó con dos enzimas (digestiones dobles).

Técnica

Esta técnica se basa en el principio de la enzimología de restricción donde de una molécula de ADN dada se obtendrán siempre los mismos fragmentos cada vez que sea expuesta a una enzima de restricción particular. La complejidad del mapa depende del tamaño de la molécula (a mayor número de bases será mayor el número de sitios de restricción) y del número de enzimas utilizadas. De esta forma, dos moléculas de ADN del mismo tamaño pueden ser fácilmente diferenciadas por los mapas de restricción que producen al tratarlas con las mismas enzimas

2.7 Nomenclatura

La nomenclatura con que se nombran las enzimas de restricción está formada por 3 letras, una letra adicional y un número, las tres letras especifican el género (la letra correspondiente al género siempre va en mayúsculas) y la especie, la letra siguiente, que va en mayúsculas, corresponde a la cepa y el número en números romanos indica el orden de identificación de ese enzima. Por ejemplo EcoRI quiere decir que es una enzima de restricción que se caracterizó en Escherichia coli, en la cepa RY13 y I, que fue la primera en identificarse en EcoR.

Las enzimas de restricción más frecuentes son un complejo multiproteico que pueden ser de tres tipos dependiendo de las acciones que pueda llevar a cabo.

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