INFLUENCIA DE LA LIMITACIÓN EXTERNA DE LA TRANSFERENCIA DE MASA

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En el presente trabajo, se investigó la aplicación de las ecuaciones anteriores para la enzima inmovilizada en la superficie en ausencia de los efectos electrostáticos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Productos Químicos La penicilina G potásica (PGK) se adquirió de Jaber Iben-e-Hayan Pharmaceutical Co. (Teherán, Irán). Las partículas de sílice de ultratina no porosas (Snowtex 30,30,4% en peso) eran un regalo de la Universidad de Kobe (Kobe) y tenían un diámetro medio de 15 nm (16, 17). Todos los productos químicos utilizados fueron de grado analítico. Producción de penicilina G acilasa y su purificación parcial Se cultivó Escherichia coli (E. cob) ATCC 1 I 105 en un medio de cultivo que constaba de: ácido fenilacético 0,2% (p / v), extracto de ternero 0,5% (p / v) . NHXI 0. I% (p / v \, KH, HPO, 0,1% (p / v> .i (H, PO, 0,01% (wiv), hgSi), 7H, O 6,026 (k / v). Se dispusieron alícuotas (100 ml) del medio de cultivo en matraces cónicos de 500 ml con tapas de pelusa y se esterilizaron a 12 1 ◦ C durante 20 minutos Los matraces se inocularon con E. coli y Se incubaron en un agitador rotatorio (220 rpm) a 24 ° C durante 46 h.Las células se cosecharon por centrifugación, se lavaron y se incubaron en tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH = 7,80). Posteriormente, las células se rompieron usando un ultrasonizador Bondlin-HD200 al La disolución de la enzima se purificó parcialmente usando una sal de sulfato de amonio y la fracción precipitó entre el 30% y el 60% de la saturación de sulfato de amonio Se recogió por centrifugación (14.000 xg, 40 min, 0_4 "C), se disolvió en tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH = 7,80), y se dializó contra el mismo tampón.No se detectó actividad de penicilinasa en la parte p Enzima urificada. Inmovilización enzimática Se mezcló una solución enzimática (4 ml) de la concentración deseada (0,446 mg / ml, que se optimizó en otra investigación) con un volumen igual de suspensión de partículas de sílice ultrafinas, y 0,1 ml de solución de glutaraldehído (1%), A esta mezcla (I 6, 17). La inmovilización se llevó a cabo, en presencia de ácido fenilacético como inhibidor competitivo de la penicilina G acilasa para proteger el sitio activo, durante 2 h a 30 ° C (IO-I2). Las partıculas ultrafinas covalentemente reticuladas a la enzima se recuperaron luego por centrifugación (14.000 xg, 40 min, 04OC). Estas moléculas de enzima inmovilizadas se lavaron y resuspendieron en tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH = 7,50) y se usaron para estudios cinéticos. En todos los experimentos, el área superficial de las partıculas utilizadas por unidad de volumen de la mezcla de reacción era de 1 μl / m. Condiciones del reactor y determinación de la velocidad de reacción Un diagrama esquemático del reactor utilizado para la medición inicial de la velocidad se presenta en la Fig. 1. Se prepararon alícuotas de 20 ml de soluciones acuosas de PGK en tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH = 8,00) a diferentes concentraciones y se iniciaron las reacciones mediante la adición de una cantidad apropiada de la enzima inmovilizada, para conseguir un tiempo lineal Para el consumo de PGK durante los primeros 15 minutos de la reacción. La velocidad de agitación para todos los experimentos fue de 170 rpm, que resultó ser la velocidad de agitación óptima en una investigación previa. Las velocidades de reacción enzimáticas iniciales se midieron mediante un método pH-stat. Este método se basa en la valoración del ácido fenilacético formado durante la hidrólisis del PGK por amoníaco. La velocidad de reacción inicial se calculó a partir de la pendiente del curso del tiempo de consumo de amoníaco en el momento de la reacción (IO, 1I). Todos los datos informados fueron valores medios obtenidos a partir de tres experimentos repetidos.

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Diagrama esquemático del reactor utilizado para las mediciones iniciales de la velocidad.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La figura 2 muestra el curso del tiempo de titulación de amoníaco a una concentración de sustrato de 0,2 mM. Como se ha indicado anteriormente, las velocidades de reacción iniciales se obtuvieron a cada concentración de sustrato. La figura 3 muestra un gráfico de la relación de y, frente a S ,, para la enzima de superficie inmovilizada, que en este estudio es convexa hacia abajo, mientras que en presencia de difusión interna para soportes porosos, un convexo ascendente sería

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FIG. 2. Tiempo de titulación del amoníaco a una concentración de sustrato de 0,2 mM.

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FIG. 3. Gráfico no lineal de $ frente a S, en la desacilación de potasio de penicilina C por penicilina G acilasa inmovilizada sobre partículas de sílice ultrafina. La línea continua representa los resultados calculados en ausencia de limitación de transferencia de masa externa.

Basándose en la concentración de sustrato inicial S ,, y despreciando el término de inhibición del sustrato a baja concentración de sustrato, la velocidad de reacción inicial puede expresarse mediante:

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Puesto que para el sistema investigado en este estudio ni el soporte ni el sustrato está cargado eléctricamente, el modificador electrostático (I #) se ajustó a la unidad. La Figura 3 indica que s la relación entre $ frente a S ,,, se convierte en lineal a altas concentraciones de sustrato. Esto sugiere que la limitación difusional externa se hace insignificante bajo tales condiciones, llevando a un valor de factor de efectividad de la unidad. Los parámetros cinéticos intrínsecos se determinan desde la línea tangencial hasta el gráfico en este alto rango de concentración de sustrato. Por lo tanto, V ,,, y K ,,, pueden determinarse a partir de la pendiente y de la intersección de esta línea. Los valores calculados para V y K ,, se encontraron como 0,150 x 1 0m3 s mm01 y 9,15 - lit 'respectivamente. Las desviaciones de esta línea se hacen más pronunciadas a concentraciones de sustrato más bajas, lo que indica importantes limitaciones externas de difusión. Las líneas tangentes a este gráfico no lineal a concentraciones de substrato más bajas se obtuvieron usando un ajuste cúbico-spline. A partir de las pendientes e intercepciones de estas líneas tangentes, los valores para los parámetros cinéticos aparentes ViW y K? Y se representan mediante cuadrados sólidos en las Figs. 5 y 6, respectivamente. Estas gráficas indican que a bajas concentraciones