LABORATORIO III “OBSERVACIÒN DE PROCARIONTES: MORFOLOGIA Y TINCIÒN”

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- Se coloca la muestra en el porta objeto luego se toma con la pinza de madera y se flamea de manera intermitente para no carbonizar la muestra, el objetivo de esto es evaporar el agua para que la muestra quede fija al porta objeto.

- Aplicamos la tinción con Safranina de manera que no quede ninguna porción sin teñir, el colorante debe actuar por lo menos un minuto.

- Se lava la preparación para eliminar el exceso de colorante, se inclina el porta objeto y se aplica agua corriente de manera que resbale por el porta objeto.

- Seque el porta objeto mediante calor suave.

- Muestra lista, se puede observar en microscopio.

- RESULTADO: Permite la visualización la concentración, morfología y el modo de agrupación bacteriana.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS TECNICAS DE TINCION:

Por todo esto las ventajas de las técnicas de tinción son:

- Permite diferenciar distintos tipos morfológicos

- Establecer una información complementaria sobre usos de estructuras internas y/o externas.

- Conocer sus características tinto riales orientándonos hacia un grupo taxonómico para la clasificación de las bacterias.

FACTORES QUE AFECTAN A TODA TECNICA DE TINCION

Las técnicas de coloración constituyen una práctica diaria en el laboratorio de microbiología por los cuales se deberá considerar una serie de factores que puedan alteras los resultados de los mismos. Así pues los principales factores son:

- Pureza del colorante.- a mayor grado de impurezas mayor error y menor calidad de tinción.

- Concentración del colorante.- a mayor concentración mayor error en la tinción; igual que a menor concentración.

- Conservación del colorante.- se debe conservarse en lugares frescos, secos, y obscuros; envasados y etiquetados.

- Técnica Empleada.- se deberá seguir rigurosamente paso a paso cada técnica de tinción.

- Temperatura.- en la mayoría de los casos se utiliza la temperatura ambiental pero si existe algunas técnicas que requieran de temperatura adecuada.

- Cantidad de la muestra.- deberá ser representativa y homogénea pero no muy grande.

- Realizar correctamente el frotis.- se debe fijarse bien para que cuando se les añada los colorantes mordientes y decolorantes no arrastren a los microorganismos que se desee observar.

- Soluciones mordientes.- en ciertos casos son necesarios ya que actúan como fijadores y ayudan a la fijación del colorante a las correspondientes estructuras.

Tiempos de Tinción.- es necesario que todas las sustancias se mantengan en la preparación un tiempo preciso y variable según la tinción

TINCION DE GRAM (100X):

[pic 8]

Tinción Gram positiva : Espora Bacillus Subtiles.

Forma: Esfera

Agrupación: Cadena

Afinidad: gran positiva (violetas)

[pic 9]

Tinción de Gram Negativa: Proteus mirabilis

Forma: Bacilo corto gram (-)

Agrupación: aglutinada

Afinidad: rosa- rojo

Tinción Simple: Epidermis.[pic 10]

Forma: Coco Gram -

Agrupación: estafilococo en forma de racimo de uva.

Afinidad: rosa - rojo

FUNDAMENTOS DE LA TINCIÓN DE GRAM

Bacterias Escherichia coli (gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.

Bacterias Clostridium perfringens (grampositivas).

Bacterias grampositivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada carbunco, encontrados en una muestra de líquido cerebroespinal. Si hubiera una especie de bacteria gram negativa, aparecería de color rosa. El resto son los leucocitos que atacan la infección.

Una tinción de Gram en la que se observa un mezclado de Staphylococcus aureus (coco gram positivo) y Escherichia coli (bacilo gramnegativo).

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 18841. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias grampositivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gramnegativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

Tinción de Gram

La tinción de gram requiere el uso de cuatro soluciones en el siguiente orden:

1. Primer Colorante: Es un colorante básico que se une a estructuras cargadas negativamente como la pared, el más utilizado es el Cristal Violeta. Como consecuencia tanto las bacterias gram positivas como las negativas quedaran teñidas.

2. Solución Mordiente: se combina con el primer colorante y forma un complejo insoluble en el caso de los gram positivos. Los mordientes suelen ser sales metálicas como el yodo presente en el Lugol. Este tratamiento no altera la coloración que adquirió con el primer tratamiento.

3. Solución decolorante: Es un disolvente orgánico, generalmente una mezcla de alcohol-acetona (1:1) mientras que este tratamiento decolora a las gram negativas no actúa en las gram positivas, manteniendo su coloración.

4. Colorante de contraste, es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, el más usado es safranina y tiñe todo aquello en la muestra que no quedo teñido post-decoloración