Laboratorio de Genética Microbiana Práctica No. 1 “Aislamiento y caracterización de DNA”.

...

x = 821.15 μg / mL

DETERMINACIÓN DE LA PUREZA DE LA SOLUCIÓN DE DNA

[pic 5]

DETERMINACIÓN DEL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DEL DNA[pic 6]

Figura 1.1 Figura 2.1 Espectro de absorción construido con los valores experimentales obtenidos de las lecturas en un intervalo de longitud de onda de 220 nm- 310 nm (Tabla 1.1) a partir del aislamiento de DNA de Escherichia coli W3350.

[pic 7]

Figura 1.2. Espectro de absorción del DNA de Escherichia coli. Se muestra la forma nativa, así como el espectro de absorción para el DNA desnaturalizado. (Tomado de Voet. D Gratzer WB, Cox RA y Doty p.)

INFLUENCIA DE DIFERENTES PARÁMETROS SOBRE LA DESNATURALIZACIÓN DE OLIGODESOXIRRIBONUCLÉOTIDOS EMPLEANDO EL PROGRAMA DNAMAN.

Influencia del contenido de GC

Oligo: 5'-TATATATGCCGTAATATATATTATATATATTAGCCGTATAT-3'

Primer1: 41 bases

Composition 15 A; 4 C; 4 G; 18 T; 0 OTHER

Percentage: 36% A; 9% C; 9% G; 43% T; 0%OTHER

GC%: 19.5

Thermo Tm = 59.5 °C %GC Tm = 55.7 °C GC+AT Tm = 98.0 °C

Oligo: 5'-AGCCGTTAATATGCCGTTTAATGCCGTATATAGCCGTATTT-3'

Primer1: 41 bases

Composition 10 A; 8 C; 8 G; 15 T; 0 OTHER

Percentage: 24% A; 19% C; 19% G; 36% T; 0%OTHER

GC%: 39.0

Thermo Tm = 74.8 °C %GC Tm = 63.7 °C GC+AT Tm = 114.0°C

Oligo: 5'-GCCGATAAATGCCGTTTGCCGAAGCCGTGCCGTTAATGCCG-3'

Primer1: 41 bases

Composition 8 A; 12 C; 12 G; 9 T; 0 OTHER

Percentage: 19% A; 29% C; 29% G; 21% T; 0%OTHER

GC%: 58.5

Thermo Tm = 88.4 °C %GC Tm = 71.7 °C GC+AT Tm = 130.0°C

Influencia de la variación en la secuencia de nucleótidos

Oligo: 5'-TATAGCCGTAGCCGTATAGCCGTTATATGCCGTTATAGCCG-3'

Primer1: 41 bases

Composition 9 A; 10 C; 10 G; 12 T; 0 OTHER

Percentage: 21% A; 24% C; 24% G; 29% T; 0%OTHER

GC%: 48.8

Thermo Tm = 76.7 °C %GC Tm = 67.7 °C GC+AT Tm = 122.0°C

Oligo: 5'-GCTTCGAAGCTATACGTTGCTACGTAGCAACGATTGCATCG-3'

Primer1: 41 bases

Composition 10 A; 10 C; 10 G; 11 T; 0 OTHER

Percentage: 24% A; 24% C; 24% G; 26% T; 0%OTHER

GC%: 48.8

Thermo Tm = 79.5 °C %GC Tm = 67.7 °C GC+AT Tm = 122.0°C

Oligo: 5'-GTACTGTCAGACAGTCTGTCGTACAGTCAGTCAGTCTGATC-3'

Primer1: 41 bases

Composition 9 A; 10 C; 10 G; 12 T; 0 OTHER

Percentage: 21% A; 24% C; 24% G; 29% T; 0%OTHER

MW=12.65 kDa

GC%: 48.8

Thermo Tm = 74.0 °C %GC Tm = 67.7 °C GC+AT Tm = 122.0°C

Influencia de la longitud de la secuencia de nucleótidos

Oligo: 5'-AATTGCCGTTGCCGATAGCCGAAAA-3'

Primer1: 25 bases

Composition 8 A; 6 C; 6 G; 5 T; 0 OTHER

Percentage: 32% A; 24% C; 24% G; 20% T; 0%OTHER

GC%: 48.0

Thermo Tm = 73.0 °C %GC Tm = 59.6 °C GC+AT Tm = 74.0 °C

Oligo: 5'-AAAGCCGTATAGCCGTTTGCCGTATAGCCGAAAGCCGTATA-3'

Primer1: 41 bases

Composition 12 A; 10 C; 10 G; 9 T; 0 OTHER

Percentage: 29% A; 24% C; 24% G; 21% T; 0%OTHER

GC%: 48.0

Thermo Tm = 79.6 °C %GC Tm = 67.7 °C GC+AT Tm = 122.0°C

Oligo: 5'-TAATGCCGTTGCCGAAGCCGTATATAGCCGTATATAGCCGAAAGCCGTTTGCCGAATA-3'

Primer1: 58 bases

Composition 16 A; 14 C; 14 G; 14 T; 0 OTHER

Percentage: 27% A; 24% C; 24% G; 24% T; 0%OTHER

GC%: 48.3

Thermo Tm = 86.3 °C %GC Tm = 71.1 °C GC+AT Tm = 172.0°C

DISCUSIÓN Tras el desarrollo de la práctica se logró el aislamiento de DNA siguiendo un protocolo de extracción para el aislamiento de DNA de un microorganismo Gram negativo, en este caso Escherichia coli W3350, su DNA cromosómico es una molécula circular grande de aproximadamente 3,2 kb de tamaño, dentro de las características genotípicas de dicha bacteria se tiene que no presenta plásmido F por lo que se facilita el aislamiento de su DNA cromosómico. Para llevar a cabo el aislamiento previamente se realizaron lavados con solución TE pH 7.8 (Tris 50 mM/ EDTA 20 mM) posterior a esto se produjo la lisis de la pared celular de la cepa lo cual se logró por la adición de lisozima para digerir la estructura de pared celular rígida que tiene grandes cantidades de lípido, mientras que el uso de detergente, en tal caso SDS, solubiliza los fosfolípidos en la membrana celular. La solución de TE (Tris 10 mM/ EDTA 1 mM) desestabiliza la envoltura celular y desactiva las DNAsa por quelación con los iones de magnesio en las membranas