Las Prácticas microbiologia general.

...

fermenten la lactosa (lactosa positiu color rosat) dels que no (lactosa negatiu translúcid.

o Incubació a 37ºC.

- Agar patata dextrosa (PDA): medi ric específic per al creixement fúngic (tant fongs filamentosos com llevaduriformes). Si a aquest medi se li afegeix cloranfenicol, el medi passa de ric a selectiu, permetent l’aïllament dels llevats presents a la mostra problema.

o Incubació a 25ºC.

Amb les colònies aïllades de tots els medis de cultiu, es va fer una preparació de cada a un portaobjectes, es va realitzar la tinció de gram per tal d’observar la morfologia i disposició dels microorganismes que havien crescut en cada medi. Tots els medis de cultiu es miren a 100X menys el PDA, que es pot veure a 40X, ja que els llevats són més grans, també amb la tinció de gram es veuen com Grampositius, però no ho son.

3. Proves bioquímiques:

Una vegada incubats els 4 medis, s’agafa una colònia aïllada formada al medi de cultiu Mac Conkey i una altra colònia formada al Manitol i cada una d’aquestes se sembra per esgotament de nansa a una placa de cultiu Mueller-Hinton (creixen sense estrés metabòlic). Aquest procés es fa per a obtenir cultius purs sense estrés metabòlic i per no obtenir falsos positius ni negatius en les proves bioquímiques posteriors.

Ja crescudes les colònies al medi Mueller-Hinton es farà la prova de la catalasa i de l’oxidasa.

- Pel que fa a la prova de la catalasa, es realitza afegint peròxid d’hidrogen (H2O2) sobre el medi de cultiu Mueller-Hinton prèviament sembrat amb els microorganismes obtinguts de la placa del Manitol.

Aquest procés es fa per comprovar l’existència de l’enzim respiratori catalasa. Aquest enzim, catalitza la descomposició del peròxid d’hidrogen en aigua i oxigen, formant “bombolles” característiques de l’alliberació d’oxigen a la superfície del medi de cultiu.

- En quant a la prova de l’enzim citocrom oxidasa, es va fer utilitzant un escuradents per tal de no obtenir un fals positiu. Amb aquest utensili es va agafar una colònia aïllada del medi de cultiu Mueller-Hinton prèviament sembrat amb els microorganismes proliferats a la placa Mac Conkey, i es diposita sobre un paper, al qual se li afegeix oxidasa. Si el paper es torna de color negre és oxidasa negatiu; si el paper es queda igual, és oxidasa positiu.

A continuació es faran servir 6 tubs amb diferents medis que ajudaran a determinar quina espècie és la nostra mostra problema.

- 3 tubs petits: aquestes tres proves es realitzen sembrant per superfície la mostra problema en tubs d’agar inclinats els quals són:

1. Citrat (tub de color verd): els components principals d’aquest tub són el citrat i el blau de bromotimol. S’incuba a 37ºC durant 24hores i després es poden mesurar els resultats.

2. Urea (tub ataronjat): les bactèries hidrolitzen la urea per mitjà de l’enzim ureasa alliberant amoníac i diòxid de carboni. Aquests productes alcalinitzen el medi de cultiu fent canviar l’indicador vermell de fenol del color groc al vermell.

3. Fenilananina (tub transparent): si les bactèries tenen l’enzim fenilalanina desaminasa, podran desaminar la fenilalanina alliberant fenilpirúvic. Aquest es detecta agregant una solució de triclorur de ferro, que dóna un complex de color verd fosc.

- 3 tubs més grans: aquestes tres proves es realitzaran fent una picadura de profunditat a tots els tubs, i menys a un tub, es fa una sembra per superfície amb la mostra problema