Nombre del trabajo: Reporte 7 de laboratorio: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de un producto de DNA para su clonación

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Bibliografía:

Fundamentos de bioquímica estructural José María Teijón Editorial Tebar, 2006 - 444 pages

Alberts, B; Jonson, A; Lewis, J; Raff, M; Roberts, K; Walter, P. 2002. Molecular Biology of the Cell. Garland Science. H

artl, D; Jones, E.2001. Genetics. Analysis of genes and Genomes. 5 th. edition. Jones and Bartlett Publishers.

Koneman. Diagnostico Microbiologico/ Microbiological diagnosis: Texto Y Atlas En Color/ Text and Color AtlasMédica Panamericana, Jun 30, 2008 - 1691 pages

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Análisis y Evaluación

- Menciona 4 aspectos a considerar en el diseño de los oligonucleótidos para usarse en la reacción de PCR.

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- Qué es hibridación y cuando ocurre en la PCR?

Es el apareamiento complementario de bases entre dos acidos nucleicos de hebra simple dando un producto de hebra doble. ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una molécula de ácido nucleico de doble cadena. Es un método muy versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos nucleicos. También permite la detección de fragmentos de DNA que son complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas). Este proceso ocurre en PCR después de la desnaturalización del DNA con la hibridación de cebadores (oligonucleótidos) específicos del DNA de cadena sencilla.

- Como la PCR se ve afectada por la fuerza iónica? Se ve afectada Durante la hibridaciónse produce la unión de las moléculas diana con las moléculas sonda. Esta unión depende de lacomplementariedad de bases. Así, aumentando la fuerza iónica (por ejemplo, la concentración decloruro sódico NaCl) o disminuyendo la temperatura se permite la hibridación aunque existanalgunas bases no complementarias.

- A parte de la Taq Polimeraza, cual otra enzima polimerasa pudiera usarse en PCR y cual seria su ventaja?

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- De que depende la Tm en la PCR, explica.

Es muy importante estimar la temperatura de hibridación o melting (Th o Tm)

de los “primers” para luego programar las condiciones de ciclado. Para calcularlas se emplea la siguiente ecuación:

Tm: (4 x (G + C)) + (2 x (A + T)) ºC

Donde (G + C) es el número de guaninas y citosinas y (A + T) el número de adeninas y timinas presentes en la secuencia del “primer”.

- ¿Cómo se ve afectada la PCR por la concentración de oligonucleotidos, templado, Mg+2. y dNTP’s? La presencia de altas concentraciones de oligonucleótidos puede causar “priming” de sitios ectópicos con la consecuente amplificación de secuencias no deseadas, por lo contrario la PCR es extremadamente ineficiente cuando la concentración de “primers” es limitad. La presencia del catión divalente es crítica, debido a que la concentración óptima de Mg+2 es muy baja (1,5mM) es extremadamente importante que ninguna de las soluciones de trabajo contenga concentraciones altas de iones con carga negativa como el fosfato. El ADN a ser utilizado como templado deberá estar disuelto en Tris/HCl (10 mM pH 7,6). El buffer estándar funciona bien en un amplio espectro de templados y “primers” pero no siempre es el óptimo para todas las combinaciones. En particular, la concentración de Mg+2 es el principal componente susceptible de sufrir variaciones, por otro lado los dNTPs son la principal fuente de grupos fosfato en la reacción y cualquier cambio en sus concentraciones afecta la cantidad de Mg+2 disponible. Por lo tanto, cuando se deseen evaluar alternativas en la concentración de Mg+2, el rango de testeo debe estar comprendido entre 0,05 y los 2 mM con un incremento de 0,05 mM para cada ensayo.

- Que parte de la tecnica realizada modificarías para hacer el metodo mas eficiente.

Modificaria el tipo de polimerasa a utilizar, ya que se pueden encontrar variaciones en la amplificación del ADN y asi poder comparar los resultados de su eficiencia

Bibliografía

- ANEXOS TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2013

- MARTA IZQUIERDO ROJO. Ingeniería genética y transferencia génica. Pirámide, 1999

- TOM STRACHAN Y ANDREW READ.Genética molecular humana. Omega, 1999

- ALINA QUEVEDO. Genes en tela de juicio. Pruebas de identificación por ADN: de los laboratorios a los tribunales. Mc Graw Hill, 1996

- ANA CÉSPEDES y colaboradores. Identificación de Pescados Planos Fileteados mediante PCR. "Ibérica. Actualidad tecnológica" nº 426 Enero 2000