Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).

...

c) 55°C 30 s (alineamiento),

d) 72°C 1 min (elongación)

e) Repetir los pasos b a d 30 veces

f) 72ºC 4 min.

g) 4ºC (refrigerar hasta el momento de uso)

- Separar el fragmento amplificado por electroforesis en un gel de agarosa.

- Verificar que el tamaño amplificado por PCR sea el esperado.

---------------------------------------------------------------

RESULTADOS

Se realizó una electroforesis en gel de agarosa 1% (p/V) para visualizar los amplicones generados a partir de la muestra de DNA de E.coli. En la primera mitad se cargaron 3 muestras: el mix de muestra, la muestra y el control negativo. En la otra mitad solo se cargaron la muestra y el control negativo.

La figura 1 muestra los resultados obtenidos de dichas electroforesis.[pic 17][pic 18][pic 19][pic 20][pic 21][pic 22][pic 23][pic 24][pic 25][pic 26][pic 27][pic 28][pic 29][pic 30][pic 31][pic 32][pic 33][pic 34]

[pic 35]

[pic 36]

[pic 37]

[pic 38]

DISCUSIÓN

En la figura 1 se muestran los resultados obtenidos de la electroforesis realizada para confirmar la obtención del amplicon del gen 16 S del DNA de E. coli.

En el pozo 4 de la sección A, es apreciable una contaminación de la muestra, ya que en este pozo se cargó el control negativo, por lo que no se esperaría encontrar una banda, debido a esto la prueba es inconsistente y debería repetirse.

En la sección C, se aprecia una amplificación tanto del mix como de la muestra, lo que indica que la cantidad de DNA fue igual en ambas amplificaciones.

En los pozos donde se cargó el control negativo es apreciable una pequeña banda, esta corresponde a los primers que no lograron unirse a la cadena de DNA y formaron compuestos de doble cadena entre sí, ya que en estos no se había una cadena de DNA a la cual podían unirse.

También se puede notar una diferencia entre la intensidad de las bandas de la amplificación de la muestra amplificada y del mix, esto debido a que la concentración de DNA en el mix es muy baja

Por otra parte se logra apreciar un producto inespecífico de 500 pb en la sección E, en la cual se aprecian dos bandas definidas.

CONCLUSIONES

- Se generó un amplicón de aproximada 600 pb del gen 16 S del DNA de la bacteria E.coli.

- Las contaminaciones pueden afectar a la lectura de los resultados, por lo que es importante mantener las condiciones de esterilidad

- Es importante cuidar la concentración de los reactivos, ya que una variación de estos puede afectar a la reacción, de tal forma que la amplificación no se realice de forma correcta.

- Otro de los factores que se deben de cuidar es la temperatura, ya que los reactivos utilizados son termolábiles.

- Al momento de realizar la reacción en el mix es importante calcular los volúmenes a la n+1 reacciones para evitar la falta de reactivos al realizar las reacciones en cada tubo.

---------------------------------------------------------------

BIBLIOGRAFÍA

Aryal, S. (23 de Abril de 2015). microbiologyinfo. Obtenido de Polymerase chain reaction : http://www.microbiologyinfo.com/polymerase-chain-reaction-pcr-principle-procedure-types-applications-and-animation/

NCBI. (s.f.). NCBI. Obtenido de Polymerase Chain reaction : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/

Serrato, A., Flores, L., & Aportela, J. (s.f.). inecc. Obtenido de PCR: reaccion en cadena de la polimerasa : http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/pcr.pdf

UGR. (s.f.). UGR. Obtenido de reaccion en cadena de la polimerasa : http://www.ugr.es/~mgarrido/PCR.htm