Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa

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Existe una serie de pasos que nos ayuda a elegir los primers con los que se trabajara, sin embargo, existen programas informáticos que nos proporcionan ayuda para la elección de estos como DNAsis, Primer3, etc.

- Se debe tener en cuenta que la relación máxima de purinas y pirimidinas debe ser de 40% y 60% y que la citosina y guanina se encuentren en un 50%.

- Evitar que, en una misma zona larga, haya bases repetidas.

- Tratar de que las terminaciones de la cadena molde termine en guanina o citosina.

- El tamaño normal de esta, debe ser aproximadamente de 18 a 30 pb.

- La hibridación de los cebadores debe tener una temperatura igual para ambos, pues esta debe estar entre 40° y 65°C.

- Si el primer no supera los 20 pb, la fórmula para la temperatura se fusión es:

[pic 1]

El DNA polimerasa que ayuda en la replicación del DNA se encuentra de diferentes tipos, pero siguiendo la misma forma de síntesis, estas son:

Termolábiles: Su temperatura optima es de 37°-42°C, este se desnaturaliza con calor.

Termoestables: Su temperatura optima es de 74° y resiste aproximadamente 40 a 50 minutos con temperaturas hasta de 96°C.

Para esta época se utiliza la Taq polimerasa, enzima termoestable aislada de una bacteria que puede soportar altas temperaturas, sin embargo, la Taq polimerasa no es tan confiable, pues puede llegar a tener errores si no se tienen las mejores condiciones. Al inicio se utilizaba una enzima termolábil aislada de E. coli, pero esta no soportaba altas temperaturas y no se podía realizar la PCR, pero esta era más confiable ya que podía contener menos errores. Hay condiciones que se pueden tratar para trabajar la Taq polimerasa y que esta nos de los mejores productos, como:

- El número de ciclos no debe superar los 25 o 30, pues el grado de error es proporcional al número de ciclos tratados en la técnica.

- Tratar de que el tiempo en cada etapa sea lo más corto posible.

- El valor de Mg no debe ser ni muy bajo, ni muy alto, pues este puede alterar la especificidad de la PCR.

El amortiguador de la reacción normalmente eta formado por 10mM tris-HCl con pH de 8,4 y una temperatura ambiente, 50 mM de KCl, 0,1% w/v gelatina y 1,5 mM de MgCl2. Además, algunos personajes aconsejan la utilización de adyuvantes, lo que ayudara a tener menos errores en la técnica.

El cloruro de potasio y el cloruro de magnesio son dos sales de gran importancia en esta técnica, pues ayudan a la desnaturalización de DNA y ajustan la temperatura de la hibridación de DNA respectivamente.

La temperatura, el tiempo de los ciclos y el número de ciclos son fundamentales en la técnica, pues modificándolos de una manera adecuada podemos obtener los mejores productos. Al principio se realizaba la técnica de manera manual, pues los tubos se cambiaban de un baño de María a otro con temperatura diferente, pero este procedimiento era muy molesto ya que no se lograba alcanzar los tiempos y las temperaturas adecuada, entonces se creó un termociclador para realizarse de manera automática.

Hay algunas formas de evitar la contaminación y si se llega a trabajar con RNA las condiciones deben ser extremamente seguras, esas son:

- El lugar a trabajar debe ser sumamente exclusivo.

- Los instrumentos deben ser especialmente para la prueba.

- Reactivos e instrumentos estériles.

- El manipulador debe portar guantes.

Esta prueba está destinada para diferentes aplicaciones, pues para la detención de mutaciones, diagnósticos prenatales, diagnóstico preimplantacional, la secuenciación de DNAs fósiles y la identificación de especies.