Ratones humanizados para la investigación del sistema inmunológico

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Tecnologías para entregar los factores humanos específicos de cada especie para mejorar la hematopoyesis humana y el desarrollo del sistema inmune y la función también son diversas. El enfoque más sencillo es el de proporcionar los factores necesarios por inyección de proteínas recombinantes (revisado en REF). Otras tecnologías incluyen la transducción de las CMH humanos con genes que codifican factores tales como ratón CD47, que regula la absorción de fagocitosis de las células y la entrega de ADN plasmido que codifica citosinas humanas por inyección en la vena de la cola hidrodinámica. Además, los vectores lentivirales se han utilizado para entregar IL7 humano en ratones BRG, promocionando la proliferación homeostática y la generación endogena de células T.

Como se describe a continuación, tres principales tecnologías de ingeniería genética se han adoptado: la expresión transgénica de construcciones de ADNc impulsadas por promotores específicos de tejido o ubicuos; expresión transgénica de cromosomas artificiales bacterianos (BAC); y ronda en la tecnología.

Las cepas de ratones transgénicos inmunodeficientes Il2rgnull se han desarrollado utilizando cDNA construcciones que expresan genes humanos bajo el control de promotores específicos de tejido de acogida o ubicuas. Sin embargo, este enfoque a menudo conduce a la expresión del transgen en los niveles no fisiológicos o que carecen de controles temporales que conducen a efectos adversos sobre el desarrollo y la función del sistema inmunológico humano en ratones humanizados. Un segundo enfoque es el uso de cromosomas humanos artificiales bacterianos (BAC) que a menudo contienen elementos reguladores críticos para la expresión génica. El uso de BACs para crear ratones transgénicos facilita la expresión de genes a niveles fisiológicos, cuando sea apropiado durante el desarrollo, y cuando funcionalmente necesario. El uso de estos enfoques transgénicos, el gen de ratón homóloga se deja intacta y por lo tanto, tanto el ratón y el gen humano de interés se expresan. Un tercer enfoque es utilizar la tecnología de knock-in en el que el gen de ratón se sustituye por el gen humano correspondiente, lo que resulta en la expresión del producto génico humano en ausencia del producto del gen de ratón. Esta estrategia se ha utilizado con éxito para múltiples genes en ratones C; 129RG debido a la disponibilidad de las células madre embrionarias (ES) de la C; strain3 129RG. Estas células ES también se pueden utilizar para desarrollar ratones knockout en el que un gen de ratón dirigido específicamente se inactiva. El desarrollo de ratones knock-in y Knockout en la cepa NOD fue obstaculizado previamente por la falta de NOD disponible células ES, pero esta limitación se ha superado recientemente por la generación de células ES basado en la cepa NOD y NSG y dará lugar a la desarrollo de knock-in y Knockout NSG y NRG ratones.

Tecnologías emergentes adicionales que pueden alterar el genoma de ratones se han descrito, incluyendo la tecnología de dedo de zinc (ZFN) y el activador de la transcripción como la tecnología nucleasa efector (TALEN). Nucleasas de dedos de zinc se han diseñado las proteínas de unión al ADN que causan doble cadena de ADN se rompe en lugares específicos y permite la edición del genoma dirigidos. TALENS utilizar de transcripción del tipo activador de efectores, secretadas por las bacterias de plantas que pueden ser diseñados para unirse a secuencias específicas de ADN. Tecnología ZFN y TALEN se puede aplicar directamente en los embriones y por lo tanto se puede utilizar para el desarrollo de nuevas cepas con el aumento de la complejidad genética que no puede ser fácilmente generada usando cruces tradicionales. Aunque, ni ZFN ni la tecnología TALEN aún no se han aplicado al campo de los ratones humanizados, estas tecnologías es probable tener un impacto importante en el desarrollo futuro modelo de ratón humanizado.

Nuevos modelos

Muchas cepas modificadas genéticamente de ratones inmunodeficientes Il2rgnull están ahora disponibles para el estudio de la inmunología humana (Tabla 1) y es probable que muchos nuevos stocks pronto estarán disponibles.

Utilizando la tecnología de knock-in, se han desarrollado tres nuevas cepas de ratones BRG que expresan factores de crecimiento hematopoyéticos humanos que son importantes en el desarrollo de células mieloides. Como era de esperar, cada factor de crecimiento humano mejorado el desarrollo del linaje de células humanas dirigida por ese factor específico. Por ejemplo, la expresión transgénica de factor estimulante de colonias de macrófagos (CSF 1) aumentó las frecuencias de los monocitos y macrófagos humanos siguientes injerto HSC humana y mejoró la producción de citoquinas pro-inflamatorias después del desafío con el receptor de tipo Toll 4 (TLR4) agonista de lipopolisacárido. Sin embargo, también se observaron eventos adversos. Por ejemplo, en la trombopoyetina (TPO) cepa knockin, incremento la mielopoyesis y se observó HSC autorrenovación, pero se desarrolló trombocitopenia. Aunque TPO humana puede soportar trombocitopoyesis murino, los niveles de TPO humana que se expresaron en el ratón fue ~ 10 veces más bajos que los niveles normales de TPO ratón. Esto llevó a la disminución de los números de plaquetas de ratón, y porque hay niveles muy bajos de plaquetas humanas circulan en la sangre de los ratones humanizados, se desarrolla trombocitopenia. En IL3 y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) knockin ratones, el injerto HSC humana resultó en una mayor desarrollo de los macrófagos alveolares humanos, pero los ratones no injertado desarrolló proteinosis alveolar pulmonar causada por la ausencia de ratón GM-CSF.

La expresión transgénica de tres factores de crecimiento hematopoyéticos (IL3, GM-CSF y SCF) bajo el control de un promotor ubicuo condujo a un aumento de las frecuencias de las células mieloides humanas en la médula ósea de los ratones injertados con GSN HSC humana. Sin embargo, estudios anteriores con estos transgenes co-integrado mostraron que la movilización de HSC mediada por GM-CSF dio lugar a frecuencias reducidas de HSCs humanas en la médula ósea en comparación con los ratones NOD-SCID no transgénicos. Aumento de los niveles de células T CD4 + Foxp3 + en los tejidos periféricos también fueron evidentes tras el injerto HSC de ratones transgénicos GSN triplemente, lo que sugiere que la exposición no fisiológica a las citoquinas durante el desarrollo de células T puede alterar la población de células generado. Esta deficiencia puede ser superada mediante el enfoque knockin en el que se espera que los niveles fisiológicos de las citoquinas.