TÉCNICA DE WESTERN BLOT WESTERN BLOT TECHNIQUE

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Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. Por tanto, es importante evitar, durate la preparación de la muestra, cualquier actividad proteásica. La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas:

- Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación.

- Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso.

- Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis. Además de inhibir la actividad de la proteasa, puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina, en particular en estudios de fosforilación7.

3 Electroforesis en Acrilamida

Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En primer lugar, las proteínas, se revisten con carga negativa, mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS), así Las proteínas, se pueden separar en el gel según su tamaño (SDSPAGE). Medición de proteína total Previamente a la electroforesis, es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones:

- Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario. Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. A menudo, para determinar la carga de proteína apropiada, se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas7.

- Realización de Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos. Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma, se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés. Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación7.

Descripción del método

Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. Los más habituales son los métodos Lowry, Bradford y Ácido Bincocinico (BCA). Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección. Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra, se debe realizar una curva estándar en cada ensayo. Esto se logra con la realización de un ensayo de concentración crecientes, de proteína pura. El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de suero bovino (BSA), aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente7.

Elección de un ensayo de proteínas Hay muchos kits de determinación de proteínas disponibles comercialmente. La elección depende de muchos factores:

- El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro, lector de placas, etc…).

- Los reactivos del tampón de lisis - revisar el protocolo del fabricante para identificar sustancias interferentes.

- La cantidad de muestra disponible.

- La facilidad/rapidez del ensayo7.

Tampón de carga de muestras

Una vez se tienen las muestras de proteína, se pueden conservar congeladas, teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/ descongelación. Alternativamente, se pueden utilizar inmediatamente, combinándolas con un tampón de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis. Los componentes del tampón de carga varían, dependiendo de las condiciones deseadas. Los ingredientes típicos de un tampón de carga para detectar proteínas bajo condiciones desnaturalizantes8.

No se utilizarán ni SDS, beta mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. Previamente a la carga del gel, las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-10 minutos, para asegurar que la desnaturalización/ reducción es total. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras, esta incubación no es necesaria8.

Gel de Electroforesis

Si se requieren condiciones naturales para que el anticuerpo pueda detectar el epítopo, en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de electroforesis. En esta situación, también conocida como PAGE nativo, las proteí- nas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su tamaño. Sin embargo, la mayoría de ensayos Western Blot, se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción, las proteínas cargadas negativamente, cuando se someten a un campo eléctrico, migran al electrodo positivo. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas, la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores. Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio. Los geles pre-fabricados son muy prácticos pero debido al coste, no son tan rentables como los elaborados por el usuario9

Elección del grosor del gel y del tamaño de poro

El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel.

∙ Los espaciadores de gel controlan el espesor del gel. Están disponibles en diversos tamaños.

∙ Los geles con mayor espesor, pueden aceptar mayor volumen de carga. También se procesarán más lentamente y requieren tiempos de transferencia más largos que los geles más delgados

∙ El porcentaje del gel, según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida, determina el tamaño del poro. A más porcentaje menos tamaño de poro.

∙ El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas10.

Elaboración del gel

Si el gel de acrilamida está elaborado en el laboratorio, los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde, formado por el conjunto de dos cristales, espaciadores lateral, espaciador inferior, peines y un sistema de