TRANSFERENCIA MEDIADA POR VECTORES DE BACULOVIRUS DE YODURO DE SODIO Y SYMPORTER PLASMINÓGENO KRINGLE 5 GENES DE RADIOYODO TERAPIA DEL TUMOR

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EL ANÁLISIS DE TRANSFERENCIA WESTERN

Los lisados ​​de células infectadas con baculovirus fueron preparados por métodos estándar.a continuación, el análisis de transferencia Western se realizó incubando el filtro con el ratón anti-NIS (1:500; Millipore), anti-His-tag (1:500; Abgent) o anti-GAPDH (1:10000; Abgent) de anticuerpos en Tris- solución salina tamponada con Tween-20 durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con conjugado de peroxidasa de inmunoglobulina de cabra anti-ratón.

ENSAYO DE PROLIFERACIÓN CELULAR

La proliferación celular se determinó utilizando el kit de recuento de células-8 (CCK-8) con WST-8 colorante (Instituto de Biotecnología Beyotime) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 5 x 10 3 células fueron sembradas por pocillo en una placa de 96 pocillos y se dividieron en tres grupos (en blanco, Bac-hTERT-0-Egr1-K5 y Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5), todos los cuales eran se incubaron durante 18 h con Na I en 5 MBq / ml. Posteriormente, las células se lavaron con bHBSS y se incubaron en presencia de 10% de FBS durante 4 días La supervivencia celular se expresó como el porcentaje de absorbancia a la del grupo en blanco sin I incubación. Los datos se representan como media ± desviación estándar (SD).

Las células que se tiñeron con FITC Anexina V positivo y PI negativos se consideran en apoptosis temprana. Los grupos sin incubación con 131 I se utilizaron para definir sus niveles basales de la apoptosis. Los porcentajes de células apoptóticas tempranas 131 grupos tratados con I A continuación se determinaron restando la tasa de apoptosis base. Todos los siguientes experimentos se realizaron por triplicado

EN GAMMAGRAFÍA TUMORAL IN VIVO Y EXPERIMENTOS TERAPÉUTICOS CON 131

Modelos de xenoinjerto de tumor se generaron mediante inyección subcutánea de células Hela viables (5 x 10 6 células suspendidas en 150 l de PBS) en la axila derecha de los ratones. Un pretratamiento de 3 días con solución de Lugol (5 l por ratón diarias) por sonda se llevó a cabo para reducir la captación de yodo por la glándula tiroides y maximizar la captación de yodo radioactivo en el tumor

Para experimentos de imagen, seis ratones se dividieron en dos grupos y se inyectaron por vía intratumoral con 5 × 10 8 unidades formadoras de placa (pfu) de Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5 y PBS, respectivamente. A las 24 h después de la infección, los ratones fueron inyectados con 7,4 MBq de Na I a través de la vena de la cola.

Después de formación de imágenes, los tumores se recogieron y se pesaron. Las regiones de interés en el tumor se cuantificaron y se expresaron como una

fracción de la cantidad total de yodo radiactivo aplicado por gramo de tejido tumoral (es decir, porcentaje de dosis inyectada por gramo,% ID / g).

Para 131 experimentos terapéuticos mediadas-I, los ratones fueron infectados con 5 x 10 8 pfu de Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5, Bac-hTERT-0-Egr1-K5 o Bac-hTERT-NIS-Egr1-0.Después de 24 h, 37 MBq de Na 131 I se administró a los ratones a través de la vena de la cola. PBS también se inyectó por vía intratumoral en dos grupos de control con o sin 131 I.Seis ratones fueron incluidos en cada grupo, y los volúmenes tumorales fueron seguidos durante 15 días. Al final del período de seguimiento, los animales fueron anestesiados, y los tumores se extrajeron y se analizaron por inmunohistología.

LA TINCIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE CD 131 Y LA DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD DE MICROVASOS (MVD)

Los tumores se recogieron en 4% de paraformaldehído durante 24 h y embebidos en parafina.

MVD se expresó como el número de microvasos por campo. Un único microvasos se definió como cualquier célula endotelial CD31-inmunotinción que se separa de las células tumorales adyacentes y otros elementos de tejido conjuntivo.

RESULTADOS

La actividad transcripcional del promotor de hTERT en células tumorales o normales

Para confirmar que la activación de la transcripción de hTERT fue hasta reguladas en las células tumorales positivas de telomerasa pero no en células normales, se realizó un transfección transitoria de plásmidos informadores de luciferasa(Gen)

La activación transcripcional inducida por el promotor de hTERT.

Figura 1 Expresión del gen NIS en células HeLa infectadas con baculovirus

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El gen NIS en el sistema de expresión de baculovirus dual fue diseñado para ser dirigido por el promotor de hTERT para la expresión génica específica de tumor. Como se muestra en la Figura 2A , NIS mRNA niveles de expresión se incrementaron notablemente en células HeLa pero no en células MRC5 después de la incubación con Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5.

Figura 2 La expresión de NIS ARNm y proteínas en células HeLa infectadas con baculovirus.

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Figura 3 La expresión de K5 mRNA y proteína

El sistema dual de expresión de baculovirus utiliza otro gen terapéutico, K5, bajo el control del promotor Egr1 para mediar en la expresión de K5 de radio-inducible en la proliferación de células endoteliales. Para identificar la viabilidad de promotor Egr1 sensibles a la radiación y determinar las condiciones óptimas de expresión, las células HeLa fueron expuestos a Na 131I para diferentes momentos o en diferentes dosis después de la incubación con Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5.

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Figura 4 En la absorción de yoduro vitro en células HeLa infectadas con baculovirus.

La actividad funcional de la proteína NIS se demostró claramente por su captación de yoduro celular. Como se muestra en la figura 4A , la captación de yoduro en células HeLa infectadas con Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5 fue rápida, alcanzando un máximo después de aproximadamente 30 min, seguido por una disminución. En 120 min después de la adición de 125 I, el nivel de absorción fue sólo 59,4% de la actividad máxima. Células HeLa infectadas con Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5 mostraron un aumento de hasta 5,6 veces en la acumulación de yoduro, en comparación con la de las células co-incubaron con perclorato (P 125I durante 30 minutos

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