Transfectadas condrocitos humanos

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aislamiento de condrocitos humanos y la cultura

condrocitos humanos se obtuvieron a partir de los restos no utilizados de tres biopsias de cartílago. Las células se recuperaron utilizando sucesivos digestiones de cartílago con 0,25% de tripsina y 2 mg de colagenasa tipo II / ml (Sigma-Aldrich Co., EE.UU.). Los condrocitos se suspendieron en medio Opti-MEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, gentamicina (0,05 mg / ml) y anfotericina B (50 ng / ml; medio completo), todos comprados a Gibcos (Thermo Fisher Scientific c, EE.UU.). Cuando las monocapas alcanzaron 80% confluencia, se recogieron los condrocitos, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (Sigma-Aldrich Co.), y su concentración se ajustó a 2? 105 células / ml en medio completo. Las alícuotas de la suspensión de células se sembraron en pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos (Corning Incorporated, EE.UU.) que contienen 1 ml de medio completo y se incubaron a 37 ° C durante 24 h en una atmósfera de CO2 al 5%.

transfección de condrocitos

Las monocapas de condrocitos en 80% confluencia se transfectaron con una mezcla del plásmido pCMV-SPORT6 EGFP y el reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche Applied Bioscience, EE.UU.), utilizando 1: 3, 2: 3, y 1: 6 proporciones de plásmido mg a FuGENE ml y se incubó a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 48 h. Se determinó el número de condrocitos fluorescentes fl usando un microscopio Nikon 50i con un epi fluorescencia iluminador (Nikon Instruments Inc., EE.UU.) a una Magni fi cación de 20 ?. La deficiencia de transfección ef se registra como el porcentaje de células fluorescentes fl calculados con respecto al número total de células observadas en ocho campos microscópicos seleccionados al azar. Este experimento se realizó por triplicado. transfección con pCMV-condrocitos SPORT6 SOX9 y pCMV-SPORT6 IGF-I se realizó utilizando 1,0 mg de ADN plásmido y 3,0 ml de reactivo Fugene 6. La cotransfección con ambos plásmidos se realizó con 2,0 mg de ADN plásmido (1,0 mg pCMV-SPORT6 SOX9 y 1,0 mg pCMV-SPORT6 IGF-I) y 6,0 ml de reactivo de transfección FuGENE6 por pocillo. Estas preparaciones se incubaron durante 3, 6, o 9 días a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%. Todas las transfecciones de condrocitos se realizaron de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante reactivo de transfección FuGENE 6.

La estimulación de la proliferación por parte de IGF-I y SOX9

Se contó el número de NTC, el IGF-I-TC, TC-SOX9, y CTC con un microscopio Nikon (Nikon Instruments) a una Magni fi cación de los 40? en ocho campos seleccionados al azar por cada pocillo de la microplaca.

La extracción total de ARN y RT-PCR

en el día 3, 6, y 9 después de la transfección (PT), el ARN total fue aislado de transfectada, CTC y NTC usando una célula de ARN y kit de purificación fi tejido (Gentra SystemsUSA).

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cDNA fue sintetizado a partir de cada preparación de RNA utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Invitrogen), y el ARN total (500 ng) se trató con 0,5 U de desoxirribonucleasa I (ADNasa I; Invitrogen) para digerir el ADN genómico. El SOX9 genes, IGF-I y el gen constitutivo gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) fueron fi cador ed mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores especí fi cos (Tabla 1). Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% (Invitrogen) y se tiñeron con 5 ml de bromuro de etidio a una concentración de 0,5 mg / ml (Sigma-Aldrich Co.). Los productos de PCR se visualizaron en un sistema de documentación de gel (UVP, Modelo M-26E; EE.UU.). Un análisis densitométrico se realizó con el software Phoretix 1D (TotalLab Ltd., Reino Unido; disponible online: ohttp: //www.totallab.com/1d-downloads/4). La densidad de cada banda se expresó como un valor normalizado a la densidad media banda GAPDH cDNA en cada gel. La densidad de las bandas de ADNc se expresaron como el número total de píxeles, y el nivel de expresión de ARNm se asumió que era equivalente a la densidad de las bandas respectivas.

RT-PCR cuantitativa

El ARN total y ADNc se prepararon según los métodos descritos anteriormente. Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR 7500 en tiempo real rápido usando placas de reacción MicroAmp 96 pocillos y TaqMan PCR Universal Master Mix. sondas TaqMan especıficos se utilizaron para detectar la expresión de Col-I (Hs00264051_m1) y Col-II (Hs00264051_m1) con GAPDH como control interno (Hs02758991_g1). Un análisis de la expresión génica se realizó mediante el método comparativo CT (DDCT). Todos los instrumentos, materiales de laboratorio y productos químicos utilizados en los experimentos QRT-PCR fueron adquiridos de Applied Biosystems (USA).

Inmunomarcaje para Col-I y Col-II

Las suspensiones de CTC, SOX9-TC, IGF-I-TC, y NTC se ajustaron a densidades de 2 104 células? / Ml en medio completo, y partes alícuotas de 500 ml se sembraron en cada compartimiento de un portaobjetos de micro-cámara de cuatro pozos (NuncTM; Thermo Fisher Scientific c). una microcámara diapositiva se preparó para cada condición de la transfección, y los portaobjetos se incubaron microcámara inmediatamente a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 3, 6 o 9 días. A continuación, el medio de cultivo se retiró y las células se fi ja con metanol-acetona (1: 1 v / v) durante 20 min a -20 ° C. El CNT, el IGF-I-TC, TC-SOX9, y CTC en la 3ª, 6ª y 9ª días PT se incubaron con anticuerpos monoclonales contra tanto Col-I (ab23446; Abcam, Inc., EE.UU.) y Col-II ( ab34712; Abcam, Inc.), y tinción positiva se detectó utilizando fi c HRP / DAB de detección de ratón-y conejo especí IHC Kit (Abcam, Inc.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Immunolabeling análisis

de los preparativos de inmunocitoquímica se examinaron a 40? con un microscopio Nikon (Nikon Instruments) equipado con una cámara digital (Labpohot 2; Nikon Instruments) con una resolución de 1600 píxeles 1200?. Ocho campos en cada pocillo de la cámara se eligieron al azar y la imagen. Las microfotografías de color se almacenan en los NEI-BR elementos de software 2.30 (Nikon Instruments) y binarizada digitalmente. El fondo fue eliminado de manera uniforme con un filtro digital y las intensidades de tinción de células se analizaron con el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.). La intensidad de la inmunomarcación