Un nuevo papel para los metabolitos secundarios de Trichoderma en la interacción con plantas

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3. Ensayos antifúngicos

La actividad antifúngica de los compuestos purificados de Trichoderma se probaron en contra de los patógenos de plantas R. solani, P. ultimum y G. graminis var. Tritici como fue descrito por Vinale y colaboradores. Rápidamente, se colocaron las tapas con el patógeno en el centro de las cajas de petri con PDA 1/5. Se aplicaron 10 µl de los compuestos purificados a la superficie de cada tapa a concentraciones que oscilaban entre 0.01 y 200 µg por tapa-1. Los controles se trataron con 10 µl de acetato de etilo solamente. El crecimiento patógeno se determinó diariamente midiendo el diámetro de la colonia en mm. Cada tratamiento se compuso de tres réplicas y cada experimento se repitió por lo menos dos veces.

4. Efecto de los metabolitos de Trichoderma en plantas inoculadas con hongos patógenos

Se obtuvo una suspensión de conidios de B. cinerea de cultivos de 10 días de esporulación en PDA en solución Tween-20 al 0.1%, se filtró a través de un vaso de lana y se diluyó a una concentración final de 5 x 105 conidios por ml-1. Una suspensión de esporas de L.maculans aislada de UWA P11 se obtuvo tal como lo reportó previamente Li y colaboradores.

Se sembraron quince semillas de tomate (Lycopersicum esculentum cv. San Marzano 823) y de canola (Brassica napus cv. Westar) en soportes de polisterol de 30 x 60 cm (consta de 60 inserciones de 4 x 4 x 4 cm) con suelo estéril. Las plantas se cultivaron en una cámara de crecimiento (22°C, 75% RU; fotoperiodo de 16 horas) y diariamente hidratadas a capacidad de campo.

Las inoculaciones de los metabolitos secundarios purificados de Trichoderma y los patógenos se realizaron individualmente en cada cotiledón de 7 días de nacidos de las semillas de colza de canola y tomate, previamente heridas con una aguja estéril de 26 G. En particular cada metabolito de Trichoderma se aplicó a un solo cotiledón a concentraciones desde 1 hasta 10 mg L-1. Tres horas más tarde el cotiledón opuesto de cada planta de canola y tomate se inoculó con una gota de 10 µl de una suspensión de espora de 1 x 106 esporas por ml-1 (que contiene una sola gota de Tween-20 como agente húmedo) de L. maculans y B. cinerea, respectivamente. Como tratamiento control en las plantas se utilizó un solvente (1 µl de metanol en 15 ml de agua esterilizada). Las plantas inoculadas se cubrieron con una hoja plástica con el fin de mantener alta humedad por 72 horas. Los síntomas de enfermedad fueron evaluados 14 días después de la inoculación usando una escala de severidad de la enfermedad de 0 – 9 para L. maculans [0= síntomas no visibles, 1= hipersensibilidad necrótica, 2= colapso tisular (1 mm de diámetro) con margen distinto, 3= manchas de colapso (2 mm de diámetro) con margen difuso, 4= manchas de colapso (3 mm de diámetro) con margen difuso, 5= manchas de colapso (4 mm de diámetro) con margen difuso, 6= manchas de colapso (5 mm de diámetro) con margen difuso, 7= manchas de colapso (> 6 mm de diámetro) con margen difuso y un poco de pycnidio, 8= colapso del tejido del cotiledón con un poco de picnidio, 9= colapso del tejido del cotiledón con masas de picnidios] y de 0 – 5 para B. cinerea (tamaño de lesión: 0= sin síntomas, 1= 20 mm). Los cotiledones de plantas infectadas y plantas control fueron cosechadas, molidas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80°C hasta ser usadas para la extracción de ARN. Cada experimento fue duplicado. Los datos de dos experimentos independientes (20 réplicas de cada uno) se combinaron porque los análisis estadísticos determinaron homogeneidad de varianza (P ≤ 0.05).

5. Extracción de ARN total

El ARN total se aisló de aproximadamente 150 ± 10 mg de tomate congelado y cotiledones de canola, se homogenizaron en TRI REAGENTTM (SIGMA) (1 ml por 50 mg de tejido). Las muestras se centrifugaron a 12,000 x g durante 15 min a 4°C y se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente. Se adicionó cloroformo (0.6 ml), la mezcla fue agitada por 15s, se dejó a temperatura ambiente por 10 min y luego se centrifugó (12,000 x g durante 15 min a 4°C). Se removió el sobrenadante y se adicionó 1.5 ml de isopropanol. Las muestras se dejaron 10 min a temperatura ambiente y se centrifugaron. El ARN total precipitado se lavó dos veces con etanol al 70% y se disolvió en agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).

6. Reacción en cadena de la polimerasa – transcriptasa reversa (RT-PCR)

Se usó RT-PCR para detectar transcriptos de varios genes en el ARN total extraído de las plantas control y plantas tratadas. Los experimentos con quitinasa clase IV de canola y endoquitinasa de tomate se realizaron a través del uso del sistema RT-PCR de un paso SuperScriptTM con ADN polimerasa platinum Taq® que permite la producción tanto de ADN complementario (cADN) como de los productos de la PCR en un solo procedimiento. Se usaron dos diferentes juegos de primers para la detección de transcriptos de plantas involucrados en resistencia inducida: QUITINASA CLASE IV (5’ -CTGCGGTTGTGCCCCAAACC-3’ y 5’-AACCACAGACCCGTCCTG-3’) y YLED (5’-AAAACAGCAACTACAACT-3’ y 5’-TACCTCCTGTAAAATCCA-3’). Los primers se diseñaron para una región de cADN de B. napus de 600 pb codificante para quitinasa clase IV, y, en el segundo caso una región de un fragmento de 300 pb de cADN de L. esculentum que codifica para una proteína endoquitinasa. Para la RT-PCR de un paso cada mezcla de reacción (50 µl) contenía: 1 µl de RNA (500 ng µl-1), 1 µl de primers sentido y anti-sentido (10 µM), 25 µl de 2 x mezcla de reacción (un buffer con contenido de 0.4 µM de dNTPs, 2.4 µM MgSO4), 1 µl de mezcla de RT/Platinum Taq® (1.5 U). El termociclador fue programado para tener síntesis de cADN seguido inmediatamente de amplificación por PCR.

Los experimentos sobre PR-1 de canola se realizaron mediante el uso de RT-PCR de dos pasos (INVITROGEN). Se sintetizó cADN por adición de la transcriptasa reversa (INVITROGEN). La primera hebra de cADN se usó como templete para la PCR con los primers PR1. Los primers se diseñaron para amplificar una región de 370 pb de cADN de B. napus codificante para la proteína PR-1. Como control se utilizó actina.