AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Y CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILA

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8.- Centrifugue durante 3 minutos a 500 rpm para sedimentar fragmentos de tejido y organelos grandes

9.- Observe muestras al microscopio iniciando con el objetivo de menor aumento

10.- Recupere el sobrenadante y centrifugue a 3000 rpm durante 10 minutos en esta centrifugación la mayor parte de los cloroplastos sedimentan

11.- Resuspenda la pastilla (pellet) de cloroplastos en 2ml de la solución de NaCl 0.35 M., con una pipeta de 1 ml suave y lentamente hasta que la pastilla se disgregue completamente

12.- Adicione 5ml mas de NaCl 0.35 M, a cada tubo

13.- Centrifugue a 3000rpm durante 10 minutos para lavar los cloroplastos

14.- Decante con cuidado el sobrenadante y resuspenda todas las pastillas en 2ml totales de amortiguador (Tris HCl 0.2M,pH8) para concentrar los cloroplastos en una sola muestra

15.- De la muestra anterior se tomará 0.1 ml para adicionarlo a 20 ml de acetona al 80% para solubilizar la clorofila

16.- Filtre a través de papel filtro

17.-Mida en el espectrofotómetro utilizando como blanco acetona al 80%, a 663 y 645 nm que corresponde a las longitudes de absorbancia máxima de las clorofilas “a” y “b”

RESULTADOS

Sustituya los valores de absorbancia en las siguientes formulas y determinar la concentración de clorofila total, clorofila “a” y clorofila “b”, obténga los valores en miligramos por mililitro

- Clorofila total = 0.0202 (abs. 645) +0.00802 (abs 663) = mg clorofila / ml

- Clorofila “a” = 0.0127 (abs 663) – 0.00269 (abs 645)

- Clorofila “b” = 0.0229 (abs 645) – 0.00468 (abs 663)

Calcule la concentración por gramo en peso fresco

CUESTIONARIO

- ¿Cuál es el fundamento de la centrifugación diferencial?

- ¿Qué papel juega el NaCl y el tris- HCl en el asilamiento de los cloroplastos?

- ¿Cuál es la importancia de una metodología como la centrifugación?

- ¿Por qué se emplean longitudes de onda de 645 y 663 mm, para cuantificar clorofila y como se relaciona con la ley de Beer?

BIBLIOGRAFIA

-Hipkins, M.F y Baker, N.R. 1986 Photosynthesis: energy transduction: a practical approach, IRL, prees, Oxford.